E.tenella河北株AMA-1重组酵母蛋白对雏鸡体液免疫及抗氧化能力的影响

闫艳娟，张东林，张海龙，李佩国，李蕴玉，庞洪泽，张香斋

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066600)

鸡球虫病是一种制约养鸡业发展的寄生性原虫病，其分布广泛，不同日龄鸡均可感染，其中雏鸡最易感，发病率和死亡率都很高，耐过鸡生长受阻且产蛋性能下降，给养鸡业带来巨大的经济损失[1-2]。到目前为止，球虫病的防治主要依赖化学药物，但由于化学药物的使用不当，导致耐药虫株产生及药物残留等问题，严重影响人们的健康，使得免疫预防受到关注[3]。鸡球虫入侵宿主的过程十分复杂，研究表明，虫体表面的多种蛋白质发挥着重要的作用。了解这些蛋白质的功能和作用，对控制球虫有一定的帮助。AMA-1是由微线体分泌的一种顶膜抗原，其功能结构域具有良好的保守性，是虫体侵入过程中重要的一类蛋白[4]。有研究表明，用不同的载体表达重组AMA-1蛋白或者质粒，对雏鸡感染E.tenella有一定的保护作用[5-6]。但关于AMA-1基因在毕赤酵母系统中表达产物的免疫原性及抗氧化能力尚未见报道。本试验将AMA-1抗原与IL-2及真核表达载体串联，转染毕赤酵母细胞GS115，构建表达载体，应用AMA-1基因的重组酵母蛋白进行动物保护性试验，分析其对球虫感染后的体液免疫水平及抗氧化能力，为研究新的球虫核酸疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物在河北昌黎某鸡场购买1日龄海兰褐雏鸡，饲喂不含抗球虫药的饲料至7日龄，粪检无球虫卵囊后作为试验鸡用。

1.2 虫株、质粒E.tenella河北株孢子化卵囊，预试验测定其攻虫量为8×104个；AMA-1重组酵母蛋白由河北省预防兽医学重点实验室表达纯化并保存。

1.3 主要试剂IgA、IgG、IgM检测试剂盒，总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 试验设计将150只7日龄雏鸡按体质量离散度随机分成5组，每组30只，1、2组分别为阴性对照组和阳性对照组，3、4、5组分别在7，14，21日龄肌肉注射50，100，150 μg重组AMA-1蛋白，对照组肌注同等量的PBS。28日龄时，除1组外，每只鸡口服E.tenella卵囊8×104个，在试验后的14，21，28，35 d，每组抽取5只采集心血，收集血清，-20℃保存备用，试验至42日龄结束。

1.5 测定指标

1.5.1特异性抗体AMA-1水平的测定 首先用不同浓度的毕赤酵母表达的重组AMA-1蛋白包被ELISA板，确定抗原与抗体最佳的反应浓度[7]，用间接EILSA法测定血清中特异性抗体AMA-1水平。

1.5.2血清IgG、IgM、IgA含量的测定 应用IgG、IgM、IgA的ELISA检测试剂盒标准品建立标准曲线，计算得到标准曲线的回归方程，检测试验后14，21，28，35 d所采集的血清，再用酶标仪在相对应的波长下检测样品吸光度值(D值)，分别在相应的回归方程中计算样品IgG、IgM、IgA的含量。

1.5.3抗氧化指标测定 T-AOC与GSH-Px活性采用比色法测定，T-SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定。

1.6 数据分析采用SPASS软件对试验结果进行分析，以P<0.05为差异显著性标准。

2 结果

2.1 血清中特异性抗体AMA-1水平测定结果由表1可以看出，第1、2组在试验14，21 d的AMA-1抗体水平无显著差异(P<0.05)，但试验28，35 d时，2组AMA-1抗体水显著高于1组(P<0.05)。3、4、5组在试验各期的AMA-1抗体水平均显著高于1、2组(P<0.05)，其中试验14，21 d时，4组AMA-1抗体水最高，依次为3组、5组，三者之间均差异显著(P<0.05)；试验28 d时，3、4组AMA-1抗体水平显著高于5组(P<0.05)，但二者无显著差异(P>0.05)；试验35 d时，3组AMA-1抗体水平最高，依次为4组、5组，三者之间均差异显著(P<0.05)。

表1 血清中特异性抗体AMA-1的水平(D值)

注：同列中上标字母相同或不标表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 血清IgG、IgM、IgA含量的测定结果

2.2.1血清IgG含量 由表2可以看出，在试验14 d，各组血清IgG含量无显著差异(P>0.05)；在试验21，28，35 d时，1、2组比较差异不显著(P>0.05)，但3、4、5组的血清IgG含量显著高于1、2组(P<0.05)，而3组在试验35 d时血清IgG含量显著高于4、5组(P<0.05)。

表2 血清中IgG的含量 g/L

2.2.2血清IgM含量 由表3可以看出，血清IgM含量随日龄增长而逐渐升高，其中各组在试验14，21，28 d的血清IgM含量无显著差异(P>0.05)；在试验35 d，3组血清IgM含量最高，与1、4、5组比较差异显著(P<0.05)，但与2组未达显著差异(P>0.05)。

表3 血清中IgM的含量 g/L

2.2.3血清IgA含量 由表4可以看出，血清IgA的含量随日龄的延长有不同程度的升高，其中各组在试验14，21d的血清IgA含量无显著差异(P>0.05)；在试验28 d，3、4组血清IgA的含量显著高于1组(P<0.05)，与2、5组比较差异不显著(P>0.05)；在试验35 d，3组血清IgA的含量最高，与1、2、4组比较差异显著(P<0.05)，但与5组比较未达显著水平(P>0.05)。

2.3 血清抗氧化指标测定

2.3.1血清T-AOC活性 由表5可以看出，各组在试验14，21 d的血清T-AOC活性均差异不显著(P>0.05)；在试验28，35 d，3、4、5组的血清T-AOC活性显著高于1、2组(P<0.05)，但3、4、5组之间的差异不显著(P>0.05)。

表4 血清中IgA的含量 g/L

表5 血清中T-AOC活性测定结果 U/mL

2.3.2血清GSH-Px活性 由表6可以看出，在试验14 d时，各组血中GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)；在试验21，28，35 d时，3组血清GSH-Px活性最高，与1、2组比较均呈显著差异(P<0.05)，除35 d的4组外，与4、5组的差异未达显著水平(P>0.05)。

表6 血清中GSH-Px活性测定结果 μmol/L

2.3.3血清T-SOD活性 由表7可以看出，在试验14，21 d时，各组血清T-SOD活性差异不显著(P>0.05)；在试验28，35 d时，3组血清T-SOD活性最高，与1、2、4、5组比较均达显著水平(P<0.05)。

表7 血清中T-SOD活性测定结果 U/mL

3 讨论

目前，对于细胞免疫和体液免疫在球虫的免疫机制中所起的作用还存在异议。有研究表明，在鸡球虫的获得性免疫中起主要作用的是细胞免疫[8]。LILLEHOJ等[9-10]将成年鸡的胸腺切除，使其丧失T细胞功能，再进行攻虫，结果显示鸡对球虫病的免疫保护性明显下降；而切除鸡的法氏囊后进行攻虫，发现鸡仍然具有免疫抵抗力。但史民康[11]和刘晶等[12]报道，雏鸡分别感染E.tenella6 d 和E.necatrix10 d 后，血液中的IgG开始增加，至18 d达到峰值，表明雏鸡体液免疫在抵抗球虫感染中发挥重要作用。SUBRAMANIAN等[13]以纯化的E.maxima配子体为抗原制作亚单位疫苗，再用强毒株感染进行动物保护性试验，结果表明其能够很好的预防鸡球虫病，提示抗体在抗球虫感染的免疫作用不应被忽视。李蕴玉等[14-15]报道，适量的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒可显著提高机体的细胞与体液免疫水平，两者协同产生坚强的免疫保护力，从而抗E.tenella攻击的保护率高达95%。本试验应用ELISA方法检测了免疫重组AMA-1蛋白后血清中特异性抗体及免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的水平，结果显示，免疫各组血清AMA-1抗体水平均显著高于1、2组，尤以3、4组最为明显。而血清IgG、IgM、IgA含量也呈一定升高趋势，尤其在试验 35 d(即攻虫后 7 d)时，3组血清IgG、IgM、IgA含量显著高于1、4组(P<0.05)，而血清IgG、IgA含量也显著高于2组(P<0.05)。说明适量的重组AMA-1蛋白能够刺激机体产生特异性抗体和免疫球蛋白，从而提高机体的体液免疫水平，与SUBRAMANIAN等[13]的研究结果一致。

有研究发现，动物体内的氧自由基可以引起脂质过氧化连锁反应，进而损害细胞膜及其生物大分子，导致细胞死亡、组织损伤甚至引发疾病。因此，细胞内氧自由基与抗氧化能力的相对平衡是细胞生存及维持机体正常生命活动的重要因素[16]。抗氧化系统主要包括酶类抗氧化系统和非酶抗氧化系统，二者均可以清除体内自由基保护机体免受损伤[17]。其中，GSH-Px与动物的抗氧化状态有直接的关联[18]。T-SOD是重要的抗氧化酶，能催化超氧阴离子的歧化并制止氧自由基的生成，在抵抗体内氧自由基防止机体损伤中发挥重要作用[19]。T-AOC水平是评价机体抗氧化系统的一项重要的综合性指标[20]。付莹等[21]研究发现，给小鼠注射T-2毒素，其血清T-SOD活性降低；李贺等[22]研究发现，传染性法氏囊病病毒感染雏鸡后，其血清T-SOD、GSH-Px活性均不同程度低于对照雏鸡。李佩国等[23]研究证实，鸡感染球虫后，机体内产生大量的氧自由基，消耗机体的抗氧化酶，酶的活性也会显著下降。因此，检测血清中抗氧化指标具有重要的意义。本试验结果显示，免疫各组血清T-SOD、T-AOC、GSH-Px活性较1、2组呈升高趋势，其中在试验 35 d 时，3组(重组AMA-1蛋白免疫剂量 50 μg/只)与1、2组比较差异显著(P<0.05)，而T-SOD、GSH-Px活性也显著高于4组(P<0.05)。由此表明适宜的重组AMA-1蛋白清除机体氧自由基的能力升高，保护机体免受氧自由基的侵害，从而也会间接刺激机体产生免疫反应，从而起到抗球虫的效果。