K亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

王瑞明，都玉印，相英杰，郭龙宗，李玉燕，李 阳，李建亮，赵 鹏，王一新*，崔言顺*

(1.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018；2.山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安 271018； 3.山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，山东 泰安 271018；4.山东益生种畜禽股份有限公司，山东 烟台 264001；5.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266114)

禽白血病(avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)引起的一种家禽肿瘤性疾病。ALV不仅引起感染鸡多种器官发生肿瘤，还能破坏鸡群的免疫功能，导致疫苗免疫失败，继发其他病原感染[1]。鉴于其带来的巨大危害和经济损失，国务院发布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》已将禽白血病列为16种优先防治的国内动物疫病之一。加强禽白血病方面的研究工作对于提高我国动物疫病防控水平、促进我国家禽养殖业健康持续发展具有重要意义。目前，尚无商业化的药物或疫苗应用于该病的预防和治疗。由于ALV主要通过雏鸡早期横向传播及鸡胚垂直传播，因此及时检测并淘汰ALV阳性鸡群是防控该病的主要方法[2-3]。

根据病毒的宿主范围、病毒间的干扰作用及病毒囊膜蛋白抗原特性，ALV可被分为A～K不同亚群[4]。其中，K亚群ALV(ALV-K)是最近在我国特有地方品系鸡群中分离到的一个新亚群[5]。目前，针对该亚群的相关研究较少，尚无针对ALV-K特异性检测方法建立的报道。建立一种快速、灵敏的诊断方法对于ALV-K的早期诊断及防控极为重要。检测ALV的最常用的方法主要有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸斑点杂交、间接免疫荧光试验(IFA)及实时荧光定量PCR等。实时荧光定量PCR技术具有快速灵敏、特异性强、可定量的优点，非常适用于病毒感染的早期快速检测。本试验以ALV-Kgp85基因为靶标，建立了检测ALV-K的实时荧光定量PCR方法，并对ALV-K感染后病毒在体内各器官的分布规律及载量进行了检测，为ALV-K感染机制的研究提供了支持。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒ALV-K毒株JS11C1由山东农业大学崔治中教授馈赠；A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A/B/J)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡传染性贫血病病毒(CIAV)、禽呼肠呼病毒(ARV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)由本实验室保存。鸡胚成纤维细胞系DF-1由本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器病毒RNA提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；10×Taq 反应缓冲液、dNTPs、Prime Star HS DNA 聚合酶、pMD18-T载体、SYBR Premix Ex Taq均购自大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。凝胶成像仪购自Bio-rad公司，7500型荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.3 引物和探针的设计下载GenBank中不同亚群ALV代表株的gp85基因序列，使用lasergene 7.0 软件比对并寻找ALV-Kgp85序列中亚群特异性的保守区域，应用Primer 5.0 软件设计针对ALV-Kgp85基因的引物P1/P2。其中，上游引物P1序列为：5′-TGGTCCAGGCCGCAACTCA-3′，下游引物P2序列为：5′-TGCTTGTGCACCCGGTCTCAG-3′，预期扩增片段长度为222 bp。本试验所用引物由上海生工公司合成。

1.4 质粒标准品的制备将ALV-K JS11C1株感染DF-1细胞，维持5 d后收集细胞，使用DNA提取试剂盒提取细胞DNA。取1 μg细胞DNA，加入10×Taq 反应缓冲液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，50 μmol/L P1/P2引物各1 μL，Prime Star HS DNA 聚合酶0.5 μL，补水至50 μL，将上述反应体系混匀后置于PCR仪扩增。参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；最后复延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测并回收纯化。纯化产物与pMD18-T载体连接并转化DH5α感受态细胞。挑取单菌落振荡培养12 h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用P1/P2引物进行PCR鉴定，阳性重组质粒送上海生工测序。使用分光光度计对重组质粒进行定量，按以下公式计算重组质粒拷贝数：拷贝数(拷贝/μL)=DNA质量浓度/DNA相对分子质量。其中，DNA质量浓度=260 nm吸光度×稀释倍数×6.02×1023，DNA相对分子质量=DNA碱基数×324.5。

1.5 实时荧光定量PCR的建立和条件优化以阳性质粒标准品为模板，将荧光定量PCR上下游引物加入到反应体系中，于ABI7500型荧光定量PCR仪进行扩增。使用矩阵法对上下游引物浓度进行优化，以得到最佳反应体系和反应条件。选用10，25，50 μmol/L的引物浓度进行筛选。

1.6 实时荧光定量PCR标准曲线的建立将1×107拷贝/μL的重组质粒进行10倍梯度稀释至浓度范围1×107～1×100拷贝/μL，以其为模板，在最佳反应条件下同时扩增，每个稀释度设置3个重复，进行荧光定量PCR反应监测，绘制标准曲线。

1.7 实时荧光定量PCR的敏感性、特异性和重复性检测将1×107拷贝/μL的重组质粒进行10倍梯度稀释至浓度范围1×107～1×100拷贝/μL，进行荧光定量PCR反应，进行敏感性检测。同时以等量的质粒DNA为模板，进行常规PCR反应，取扩增产物5 μL，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，计算2种方法所能检测出的最低模板浓度，比较两者敏感性的差异。

分别以ALV-A/B/J、REV、MDV、CAIV、ARV的DNA或cDNA为模板，使用所建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，同时设置去离子水为阴性对照。

对不同梯度浓度稀释的质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，每个梯度进行3次反应，通过组内的Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)评估所建立方法的重复性。另外，取3份ALV-K感染鸡的肝脏样品，以其组织DNA为模板进行荧光定量PCR检测，分析该方法的批内和批间重复性。批内重复：将上述3份DNA分别设立3个重复，在同一条件下同时检测，计算批内变异系数；批间重复：将上述3份DNA在同一条件下进行3次独立的荧光定量PCR检测，计算批间变异系数。

1.8 SPF雏鸡人工感染试验取SPF鸡胚60枚，分为2组：ALV-K攻毒组和空白对照组，每组30枚鸡胚。在6胚龄时，攻毒组每枚鸡胚通过卵黄囊接种104TCID50的ALV-K JS11C1毒株，对照组通过卵黄囊接种相同体积的PBS缓冲液。鸡胚孵出后，所有试验鸡在相同条件的隔离罩中隔离饲养。分别于接种后1,3,7,14,21,28,35,42 d随机选取攻毒组和对照组各5只鸡剖杀，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊，通过DNA提取试剂盒提取组织DNA，使用本研究建立的荧光定量PCR方法进行病毒载量的检测。

2 结果

2.1 ALV-Kgp85基因的PCR扩增和重组质粒的构建以感染ALV-K的DF-1细胞DNA为模板，使用P1/P2引物进行PCR扩增，获得222 bp的特异性条带。将其回收纯化并克隆至pMD18-T载体中，构建重组质粒pMD18-gp85。重组质粒的双酶切检测结果显示，pMD18-gp85上携带有200 bp左右的片段，与预期大小一致。测序结果进一步证实，扩增得到的片段与参考序列同源性达到99.9%。使用试剂盒提取标准品质粒，分光光度计测定浓度为610 mg/L，D260/D280为1.85，将质粒标准品置于-20℃保存备用。

2.2 实时荧光定量PCR的建立和条件优化对实时荧光定量PCR的反应条件进行优化，确定引物的最佳浓度分别为10 μmol/L。反应体系为20 μL，其中含10 μL 2×Premix Ex Taq Mix缓冲液，Rox reference dyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，用去离子水补足体积。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s(收集荧光信号)，扩增40个循环。

2.3 标准曲线的建立使用优化后的条件进行实时荧光定量PCR反应，以10倍梯度浓度稀释的pMD-18-gp85为模板扩增，获得了检测ALV-Kgp85基因的扩增曲线(图1A)。结果显示，该方法在模板浓度为107～100拷贝/μL具有良好的线性关系，R2值达到0.999。pMD-18-gp85荧光定量PCR熔解曲线如图1B所示，可见在Tm=87.2℃附近出现单一特异峰，无引物二聚体及非特异性产物。图2为AVI公司SDS分析软件生成的标准曲线，横坐标为质粒标准品拷贝数的对数值(X)，纵坐标为Ct值。拷贝数对数值(X)与Ct值的关系为y= -2.954x+31.633。

图1 实时荧光定量PCR检测的扩增曲线和溶解曲线 A.扩增曲线；B.溶解曲线;1.1.0×107拷贝/μL;2.1.0×106拷贝/μL;3.1.0×105拷贝/μL;4.1.0×104拷贝/μL;5.1.0×103拷贝/μL;6.1.0×102拷贝/μL;7.1.0×101拷贝/μL;8.1.0拷贝/μL;9.空白对照

图2 实时荧光定量PCR检测的标准曲线

2.4 实时荧光定量PCR的敏感性、特异性和重复性试验结果通过对重组质粒pMD18-gp85各稀释度样品进行实时荧光定量PCR检测，结果显示本方法对重组质粒进行扩增最低可以检测到1个病毒核酸分子拷贝，而常规PCR方法在100个病毒拷贝时能观察到目的条带(图3)。这表明，本试验所建立的实时荧光定量PCR方法比普通PCR高出约100倍。用所建立的实时荧光定量PCR方法对ALV-A/B/J、REV、MDV、CAIV、ARV的DNA或cDNA进行检测，检测结果均无扩增信号，而质粒标准品有良好的扩增，表明该方法具有良好的特异性。取3份ALV-K感染鸡的肝脏，提取组织DNA，进行实时荧光定量PCR检测并对扩增结果进行统计。结果显示，批内重复和批间重复的变异系数均小于2%(表1)，表明该方法具有良好的重复性，可以进行稳定、可靠的检测。

2.5 ALV-K感染鸡体内病毒分布及病毒载量的检测将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊途径接种SPF鸡胚，雏鸡孵出后，分别于接种后1，5，7，14，21，35，42 d剖检感染组和空白对照组鸡，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊等器官，通过DNA提取试剂盒提取组织DNA，利用本研究建立的荧光定量PCR方法检测各脏器中病毒分布和载量。结果表明，在检测的时间点内，各组织中均能检测到病毒存在(图4)。其中，心脏、脾脏、肺脏、肾脏中病毒含量相对较多；雏鸡孵出后1～21 d病毒载量变化不大，35 d后各组织中病毒载量显著降低。对照组鸡在试验期间检测结果均呈阴性。

图3 常规PCR敏感性试验 M.DL2000 DNA Marker;1.1.0×107拷贝/μL;2.1.0×106拷贝/μL;3.1.0×105拷贝/μL;4.1.0×104拷贝/μL;5.1.0×103拷贝/μL;6.1.0×102拷贝/μL;7.1.0×101拷贝/μL;8.1.0拷贝/μL;9.空白对照

表1 荧光定量PCR检测的重复性试验

图4 感染ALV-K鸡不同组织器官中病毒拷贝数的比较

3 讨论

ALV属于反转录病毒科、反转录病毒属，其基因组是由gag、pol和env等3个编码基因及两端的非编码序列LTR组成的。其中，env基因编码gp85和gp37等2种糖蛋白，gp85为表面蛋白，它与宿主的中和反应以及病毒的致病特性密切相关，同时也是ALV亚群分类的依据。ALV-K是近年来在我国地方品系鸡群中分离到的一个新亚群病毒，原型株为分离自我国芦花鸡群的JS11C1株[5]。序列分析表明，JS11C1株gp85基因与其他亚群gp85基因的同源性仅为38.3%～82.7%[6]。当通过卵黄囊或鸡胚静脉途径接种病毒时，JS11C1可以诱发持续性病毒血症、降低鸡群对新城疫灭活疫苗和H9亚型禽流感灭活疫苗的体液免疫应答反应、并可诱发淋巴细胞肿瘤(待发表文章)。流行病学调查研究显示，近年来ALV-K在我国的检出率呈上升趋势，我国多个地方品系鸡种如芦花鸡、东乡黑鸡、龙胜凤鸡等广泛存在ALV-K的感染，严重威胁着我国地方品系鸡群的饲养和繁育[7-9]。

目前，世界范围内尚无商业化的药物或疫苗可应用于ALV的预防和治疗，及时淘汰ALV阳性鸡群是防控该病的主要方法，建立一种快速、灵敏的检测方法对于ALV-K的早期诊断极为重要。目前，常使用的ALV病原检测方法包括病毒分离鉴定、免疫荧光试验、核酸杂交技术等[10-12]。病毒分离鉴定和免疫荧光试验对实验室的硬件条件和操作者的技能要求较高，不适合广泛推广；核酸杂交技术虽然操作相对简单，结果判断准确直观，但也需要 2 d时间；而实时荧光定量 PCR技术相对于常规PCR等检测方法，不仅有着更高的特异性和灵敏度，而且大大缩短了检测时间[13]。

本试验通过比对不同亚群ALVgp85基因的序列，设计了1对针对ALV-Kgp85基因的特异性引物，通过对反应条件和反应体系的优化，建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法最低可检测到初始模板中1个拷贝的病毒核酸，其灵敏度是常规PCR的100倍。特异性和重复性检测结果表明，该方法与其他常见免疫抑制性病原以及ALV其他亚群病毒均无交叉反应；无论是批内重复试验还是批间重复试验，其Ct值的变异系数均在2%以下。本试验所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为ALV-K的快速诊断和病毒准确定量奠定了基础。

由于K亚群是在我国地方品系鸡群中最新分离到的ALV亚群，因此目前针对ALV-K致病性及其致病机制的研究报道较少。本试验将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种SPF鸡胚，利用所建立的荧光定量PCR方法，对感染鸡体内各组织器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。由于ALV在感染鸡体过程中，需要将病毒RNA反转录为cDNA并整合到宿主基因组中，因此本试验直接从鸡组织器官的DNA中检测病毒核酸。结果显示，在雏鸡出壳后的42 d内，均可检测到病毒存在，心脏、脾脏、肺脏、肾脏中病毒含量相对较多。董征英等[14]报道，ALV-J感染雏鸡后，鸡的胸腺、肺脏、脾脏、法氏囊、肾脏、心脏病毒含量依次降低，病毒分布规律的差异有可能与病毒亚群或者攻毒方式有关。此外，在雏鸡孵出后1～21 d病毒载量变化不大，35 d后各组织中病毒载量显著降低，但胸腺和法氏囊中病毒含量仍相对较高。这提示，淋巴细胞有可能是ALV-K感染鸡体的靶细胞，这与我们前期动物试验验中ALV-K感染可诱发鸡的淋巴细胞肿瘤相吻合。

本试验建立了针对ALV-Kgp85基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，可作为ALV-K早期感染的重要检测手段，该方法同时为ALV-K感染机制的研究提供了良好的技术支持。