闽西地区猪流行性腹泻病毒S基因遗传进化特征及序列分析

董 波，傅云扉，戴爱玲，李晓华，杨小燕*

(1.龙岩学院 生命科学学院,福建 龙岩 364012;2.福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室,福建 龙岩 364012)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是冠状病毒科冠状病毒属成员，为单股正链RNA病毒，对脯乳期仔猪有较强的感染性[1]。PEDV是猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的致病原，感染仔猪主要临床表现为消化不良、腹泻、脱水、呕吐以及消瘦等，感染率和病死率颇高[2]。当前，PEDV已经在世界范围内流行，特别是在亚洲、欧洲和美洲国家[3-5]。2013年，一场PEDV疫情席卷美国，给养猪业造成了巨大的经济损失，引起了全球的关注。PEDV于1984年首次在我国被发现，因为其高致病性和高死亡率，一直给我国养猪业带来难题和挑战。2010年末，我国暴发PEDV，给河北、安徽、广西、广东，浙江、江西、四川、湖南、福建等省市的养猪业带来不小震动[6]。在本次疫情中，感染仔猪出现水样腹泻、脱水、呕吐等特征症状，死亡率高达100%。此次疫情造成的损失惨重，甚至之前接种过PEDV疫苗的猪群也同样发病，究其原因，可能是由于流行毒株变异或者毒力增强，使现有的疫苗难以提供免疫保护[7]。除此之外，本次疫情迅速蔓延到世界其他国家。例如，日本、加拿大、墨西哥和哥伦比亚等国家也经历了PEDV的持续暴发[8]。据报道，当前世界范围内PEDV的流行毒株是新型PEDV毒株，且毒性极强。

PEDV编码2个复制酶多聚蛋白ppla和pplab，1个结构蛋白ORF3和4个结构蛋白：纤突蛋白(spike,S)、膜蛋白(membrane,M)、核壳蛋白(nucleocapsid,N)和小膜蛋白(envelope,E)[9]。自20世纪90年代以来，定期接种疫苗策略已在福建省养猪场中广泛实施，然而，免疫接种未能在2010年有效预防PEDV，表明本次PEDV暴发毒株的毒性增强，以疫苗毒株CV777作为免疫原生产的疫苗未能提供有效保护，从而降低免疫接种的有效性。因此，分析当前流行毒株的基因特征和遗传规律，研发针对性强的流行毒株疫苗是当务之急。

S基因是PEDV的主要结构基因之一，在诱导病毒进入和宿主细胞融合中起关键作用[10]。同时，有报道指出S基因是揭示PEDV遗传多样性最有用的基因，在2010年大规模暴发的PEDV也与S基因的遗传变异有关[11]。此外，研究表明S基因含有4个中和表位区域，可以诱导宿主体内产生中和抗体[12]。因此，S基因是分析PEDV进化特征、遗传多样性以及重组研究的最优佳选择，可以更为清楚地了解PEDV流行病学参数从而更好地控制和预防PEDV。本试验鉴于S基因在PEDV流行病学研究中的重要性，收集了2016年1月—2017年12月闽西地区规模化猪场送检PEDV阳性病例，采用RT-PCR技术，扩增阳性样品全长S基因，进行同源性比较，绘制系统发育进化树，理清闽西地区PEDV与国内外流行毒株以及疫苗毒株之间的遗传进化关系。本试验旨在为进一步分析我国PEDV的遗传进化提供理论基础，并为开发新型PEDV疫苗提供流行病学资料，以更有效地预防PEDV仔猪。

1 材料与方法

1.1 样品样品来自2016年1月—2017年12月送往龙岩学院病毒性腹泻研究室的6份PEDV阳性病例，6份病例均伴有水性腹泻、脱水等典型症状。待病畜死亡后，收集小肠组织及肠道内容物等样本。

1.2 主要试剂AxyPrep总RNA小量制备试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、AxyPrep凝胶回收试剂盒，购自康宁生命科学(吴江)有限公司；dNTP、反转录酶M-MLV、5×M-MLV Buffer、pMD18-T Vector，购自宝生物工程(大连)有限公司；DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer，购自广州瑞真生物技术有限公司；Oligo(dT)18、Murine RNase Inhibitor、T4DNA Ligase、10×Ligase Buffer，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；胰蛋白酶(Tryptone)、酵母(Yeast Extract)，购自OXOID公司；Ampicillin(100 g/L)、NaCl、琼脂粉，购自Biowest公司；异丙醇、三羟基甲基氨基甲烷(Tris 碱)、溴化乙锭(EB)、氯仿、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、DEPC水，购自广东省汕头市西陇化工股份有限公司。

1.3 病毒总RNA提取和RT-PCR按照试剂盒中提供的操作手册，自小肠组织及其内容物中提取总RNA。取洁净EP管，加入RNA 11 μL、Oligo(dT)18 1 μL，12 000×g离心40 s，于70℃水浴10 min，加入5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水 6 μL，混匀后，42℃水浴30 min，95℃ 水浴10 min。cDNA于-80℃下保存。以cDNA作为模板，采用文献[13]中的特异性引物分段扩增S基因。PCR反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，观察并记录结果。

1.4 克隆和测序采用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将纯化产物克隆到pMD19-T载体上，将连接产物10 μL转化入DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。提取质粒，进行鉴定。阳性克隆体被送往上海生工生物工程技术服务有限公司(中国，上海)进行测序。

1.5 序列及遗传进化及重组分析6株闽西毒株分别命名为：FJLY1601、FJLY1602、LY201402、FJLY1701、FJLY1702和FJLY1703。使用表1中标准毒株的基因库登录号，获取参考毒株S基因序列。通过DNAMAN分析软件对基因序列进行编辑、比对和分析。使用MEGA5.2构建核苷酸序列系统发育树[14]。将6株闽西毒株S基因与本试验引用毒株的S基因核苷酸序列进行相似性和重组鉴定。使用遗传算法(GARD)对重组位点进行筛选[15]。使用SimPlot 3.5对潜在重组事件进行相似性映射和自助扫描分析[16]。

表1 序列比对及系统发育分析中引用的PEDV毒株

2 结果

2.1 同源性及系统发育分析核苷酸序列同源性分析结果显示，闽西毒株之间同源性为96.2%～100.0%，与早前国内外毒株同源性较低，与疫苗毒株CV777同源性仅在92.2%～94.1%之间。闽西毒株与当前国内流行毒株以及美国流行毒株同源性为96.0%～97.3%。遗传进化分析可知，本试验中32株毒株可分成2大组(G1和G2)。G1包括疫苗毒株CV777、早期经典毒株(LZC和 SM98)、细胞培养毒株(Attenuated DR13)以及早期中国毒株；G2则包括2013年分离的4株美国毒株、 2010年后分离的中国流行毒株以及6株闽西毒株(图1)。系统发育分析显示，闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株的亲缘性较远，与2010年以后中国分离毒株的亲缘性较高，与2013年美国毒株亲缘性也较高，说明闽西毒株与目前国内以及美国流行毒株可能来自同一祖先。

2.2 序列分析PEDVS基因包含4个可诱导中和抗体的区域，COE (499～638 aa)、SS2 (748～755 aa)、SS6 (764～771 aa)和2C10 (1 368～1 374 aa)[12]。本试验中，与疫苗毒株CV777相比，闽西菌株COE中存在8～11个突变(表2，图2)，这些突变与2010年后我国流行毒株以及2013年美国流行毒株突变位点相同。同时，另外3个表位区域中，SS2呈现保守性，未发生突变，而在SS6表位区中出现1～2突变位点，在2C10表位区中存在0～1个突变位点(图2)。

2.3S基因的重组分析使用遗传算法重组检测(GARD)对闽西菌株以及其他引用菌株S基因进行系统发育不一致和重组事件的比对与初步筛选。结果显示，突变点来源于主要位于S基因5′端1 000～1 500 bp。通过SimPlotv.3.5.1进一步评价核苷酸序列的相似性，发现福建PEDV闽西毒株与G2组其他毒株核苷酸序列相似性较高(图1)，可以推断来自于同一祖先。然而，该区域与G1组毒株存在差异(图1，3)。

图1 S基因系统发育分析

表2 COE区域突变位点

3 讨论

PEDV是引起仔猪腹泻的主要致病原之一，近年来，PEDV的感染率已经超过了猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒，给我国养猪业造成严重影响[17]。通过对我国PEDV分子流行病学调查研究发现，中国流行毒株与早期PEDV毒株结构基因的亲缘关系较远，表明2010年后中国流行毒株属于一个新的基因型[18]。本研究发现闽西毒株与2010年后我国流行毒株遗传关系更接近，属于目前国内流行株。同时，本试验结果表明，闽西毒株与疫苗毒株CV777以及中国、韩国和欧洲早期分离毒株存在遗传差异，亲缘关系较远。

已有研究表明，PEDVS基因在病毒入侵宿主细胞以及病毒变异中发挥着重要的作用，被认为是遗传特征研究中最具参考价值的靶基因[19]。本试验通过对S基因同源性及遗传进化分析后发现，闽西毒株与目前国内外流行毒株之间具有较高的同源性，遗传关系更密切，可能由同一祖先进化而来。并且，遗传进化分析显示，闽西FJLY1703毒株与广东分离毒株GD-01[20]位于同一亚群。同时，与疫苗毒株CV777相比，闽西FJLY1703毒株在中和表位COE区域中存在8个突变，这也与广东毒株GD-01突变位点相一致。另外，闽西FJLY1703毒株和广东毒株GD-01在其他中和表位区域中，均只存在1个相同突变位点(SS6 Y→S 766aa)。这些结果提示我们，广东省与闽西地区相邻，动物运输可能是PEDV传播的危险因素之一，因为在这2个省份之间存在猪只或猪肉产品的流通。

图2 闽西毒株与CV777毒株S基因中和表位区域的比较

图3 闽西毒株潜在重组事件分析

本试验将闽西毒株S基因序列进行比对分析后表明，闽西毒株S基因存在一定的插入和缺失，这些变异基本位于S基因的5′端，这些变化与当前国内其他流行毒株相似。此外，与CV777中和抗原表位区域相比，闽西毒株抗原表位COE区域中存在8～11个突变位点，SS6和2C10中也存在突变位点。有报道推测流行毒株S基因中存在插入或缺失以及抗原表位区域的位点突变，致使PEDV变异毒株具有更强的致病性和抗原性，最终导致2010年中国PEDV的大爆发[12,21]。本研究结果表明，闽西毒株与疫苗毒株CV777在基因水平上存在差异，提示以CV777为免疫原开发的疫苗对当前PEDV的预防和控制效果并不理想，需要开发新的针对性疫苗。

据报道，当前国内PEDV流行毒株属于一种重组毒株，而重组事件主要发生在经典毒株和变异毒株的S基因上，即来源于弱毒疫苗株(CV777或DR13)和高致病性变异毒株[18,22]。为了进一步研究闽西毒株的进化特征和重组关系，本试验将闽西毒株S基因进行重组分析，结果表明，闽西毒株S基因5′端1 000～1500 bp处存在断点，5′端部分区域并非来自于疫苗毒株CV777以及其他早期PEDV毒株，表明S基因的这一区域出现了较大的分化。重组分析同时表明，闽西流行毒株与国内其他大流行毒株相似，是一种S基因发生变异的新毒株，可能起源于经典毒株和变异毒株之间的基因重组。

综上所述，闽西毒株S基因相互之间保守性较好，与当前国内流行毒株之间具有较高的同源性，证明闽西流行毒株属于2010年后分离的中国流行毒株。同时，本试验结果表明，当前PEDV流行毒株S基因中存在抗原表位突变，可能导致了疫苗接种失败。这些结果进一步强调研究与开发新型PEDV疫苗以及加强PEDV疫苗管理的必要性。