乌龙茶多糖脱色和脱蛋白工艺研究

黄秀红 刘丽辰 阮怿航 彭启良 程博思 林金科，2＊

（福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；福建农林大学安溪茶学院，福建 福州 350002）

茶多糖是茶叶中一种有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、清除自由基、抗疲劳、抗凝血、抗血栓作用、增强免疫调节、抗肿瘤、抑菌、抗病毒活性等功能[1-4]。

茶叶粗多糖中含有蛋白质等多种杂质，因此需要进行脱蛋白处理。目前常采用的脱蛋白方法有酶法、Savage法、NaOH 法、三氟三氯乙烷法、等电点法、阴离子交换树脂法、三氯乙酸法等[5-8]。

茶叶中含有多种色素，其中多酚类物质在多糖的提取分离中影响最大，酚类物质容易氧化，对茶多糖的结构和作用机理具有重要的影响，所以需要对茶多糖进行脱色处理[9]。目前植物多糖常用的脱色方法有活性炭法、过氧化氢法、纤维素层析法、分级沉淀法、大孔树脂脱色法等方法[6，10-11]。

为了获得更高多糖提取率寻求安全绿色环保茶多糖脱色脱蛋白工艺，本实验以乌龙茶多糖为研究对象，比较活性炭、木瓜蛋白酶、AB-8树脂、D101树脂、PHD500树脂的脱色脱蛋白效果，筛选出安全的乌龙茶多糖脱色脱蛋白方法，为茶多糖的提取纯化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌龙茶：购买于福建惜缘茶叶有限公司；考马斯亮兰试剂盒：南京建成生物工程研究所；D-半乳糖醛酸：上海麦克林生物化学有限公司；双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒：索莱宝生物科技有限公司；木瓜蛋白酶：北京Solarbio公司；AB-8树脂、D-101树脂、 PHD-500树脂、活性炭：郑州勤实科技有限公司；无水乙醇、重蒸苯酚、浓硫酸、乙酸乙酯、葡萄糖；购置于国药集团上海化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

恒温水浴锅(HH-6)：国华电器有限公司；水浴摇床(MQS-30S)：旻泉仪器有限公司；电子天平(GL-124-1SCNsartorius)：上海精天电子仪器有限公司；可见分光光度计(721N)：上海精密科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机 (LGJ-12)：北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗乌龙茶多糖的制备

将干燥的乌龙茶用高速粉碎机粉碎，过80目筛，放冰箱备用。精确称取2.00 g茶粉于离心管中，按料液比1：20 g/mL的比例加蒸馏水，于60℃下恒温浸提，用抽滤机抽滤，再用高速离心机离心30 min(3500 r/min)取上清液，将上清液浓缩，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜，次日离心30 min(3500 r/min)收集沉淀，分别用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤沉淀，每次洗涤充分搅拌，最后高速离心机离心30 min(3500 r/min)取沉淀，将沉淀置于真空冷冻干燥机中，得到粗乌龙茶多糖，粗多糖的得率为4.63%。

1.2.2 脱色工艺的研究

1.2.2.1 活性炭脱色 参照刘力萍[7]的方法进行略微修改。

1.2.2.2 大孔树脂脱色

大孔树脂的预处理 参照马若影[10]的方法进行大孔树脂的预处理。

筛选最佳大孔树脂 参照马若影[10]的方法进行。

1.2.2.3 测定方法 按照马若影[10]的方法进行。

1.2.2.4 脱色效果评价方法 参照刘力萍等[7]的方法进行。

1.2.3 脱蛋白工艺研究

1.2.3.1 木瓜蛋白酶脱蛋白 参照陈丽娟[13]的方法进行。

1.2.3.2 大孔树脂脱蛋白 参照马若影[10]的方法进行并稍微修改。

1.2.3.3 测定方法

蛋白脱除率 根据考马斯亮兰试剂盒说明书的方法测定蛋白质浓度。

1.2.3.4 脱蛋白效果评价方法 参照贾文聪等[14]的方法进行。

1.2.4 茶多糖化学成分分析

中性糖含量的测定 参照苯酚-硫酸法[12]进行测定。

蛋白质含量的的测定 根据双缩脲法蛋白质含量检测试盒说明书的方法，于波长540nm处测定吸光度，根据公式计算蛋白质含量。

糖醛酸含量的测定 参照邵淑宏[6]的方法测定。

1.2.5 数据分析与统计方法

所有的试验均平行重复3次，使用SPSS17.0对数据进行统计分析，其中p＜0.05具有显著性差异，p＜0.01具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同脱色方法对乌龙茶多糖脱色效果差异分析

2.1.1 活性炭脱色

在0.03-0.12g/mL时，随着活性炭用量的增加，乌龙茶多糖的脱色率先快速增加后缓慢增加，而多糖保留率逐渐减少(见图1)。当活性炭用量在0.03-0.06 g/mL时，脱色率增加明显，在0.06-0.12 g/mL时，脱色率增加缓慢，但是多糖保留率下降较快。当活性炭用量为0.06g/mL，乌龙茶多糖的脱色率为72.11%，多糖的保留率为39.62%。因此，活性炭的最佳用量为0.06 g/mL。

图1 活性炭用量对茶多糖脱色率的影响

2.1.2大孔树脂脱色

当AB-8树脂在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加，乌龙茶多糖的脱色率在上升，多糖保留率在下降（见图2）。当树脂在0.2-0.6g/mL时，脱色率增加缓慢，多糖保留率明显下降。在0.6-0.8g/mL时，脱色率增加缓慢，且多糖保留率低。当树脂用量在0.2g/mL时，乌龙茶多糖的脱色率为26.99%，多糖的保留率为67.44%。综合来看，AB-8树脂的最佳用量为0.2g/mL。

图2 AB-8树脂用量对茶多糖脱色率的影响

当D101树脂在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加，乌龙茶多糖的脱色率先缓慢增加后快速增加，而多糖保留率逐渐减少（见图3）。当树脂用量在0.2g/mL时，乌龙茶多糖的脱色率为19.04%，多糖的保留率为69.67%。此时，树脂用量少，但是脱色率效果较好，且多糖率较高。综合来看，D101树脂的最佳用量为0.2g/mL。

图3 D101树脂用量对茶多糖脱色率的影响

在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加，乌龙茶多糖的脱色率先缓慢增加后快速增加，而多糖保留率逐渐减少（见图4）。当树脂用量在0.2g/mL时，乌龙茶多糖的蛋白脱除率为23.19%，多糖的保留率为70.78%。此时，树脂用量少，但是脱色率效果较好，且多糖率较高。综合来看，树脂PHD500的最佳用量为0.2g/mL。

图4 PHD500树脂用量对茶多糖脱色率的影响

2.1.3不同脱色方法脱色效果评价

以脱色率和多糖保留率为指标，比较四种脱色剂的脱色效果。结果如表1，活性炭的脱色率最好（P＜0.05），但是多糖保留率也最低（P＜0.05）；AB-8树脂的脱色率低于活性炭（P＜0.05），高于D101树脂（P＜0.05）和PHD500树脂，但是多糖保留率低于活性炭（P＜0.05）、D101树脂和PHD500树脂（P＜0.05）。D101树脂的脱色率最低，与活性炭、AB-8树脂和PHD500树脂差异显著(P＜0.05）。从加权评分法分析可以看出活性炭的评分最高，PHD500树脂次之。但是从实验中发现，用活性炭脱色过程中会有黑色素残留。综合考察，选择PHD500树脂对乌龙茶多糖进行脱色处理。

表1 4种脱色方式脱色结果比较

2.2 不同脱蛋白方法对乌龙茶多糖脱蛋白效果差异分析

2.2.1 木瓜蛋白酶脱蛋白

当木瓜蛋白酶添加量在2-8%时，随着酶添加量的增加蛋白脱除率在上升，多糖保留率在下降（见图5）。当木瓜蛋白酶添加量在2-6%时，蛋白脱除率有明显的增加。在6-8%时，蛋白脱除率仍有增加，并且多糖保留率下降缓慢。当木瓜蛋白酶添加量为8%时，乌龙茶多糖的蛋白脱除率为56.03%，多糖的保留率为56.85%。因此，木瓜蛋白酶的最佳添加量为8%。

图5 木瓜蛋白酶添加量对茶多糖蛋白脱除率的影响

2.2.2 大孔树脂脱蛋白

当AB-8树脂用量在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加，多糖保留率下降（见图6）。当树脂用量在0.2g/mL时，乌龙茶多糖的蛋白脱除率为57.76%，多糖的保留率为66.44%。此时，树脂用量少，但是脱色率效果较好，且多糖率较高。综合来看，树脂AB-8的最佳用量为0.2g/mL。

图6 AB-8树脂用量对茶多糖蛋白脱除率的影响

当D101树脂在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加蛋白脱除率在上升，多糖保留率在下降（见图7）。当树脂用量在0.8g/mL时，乌龙茶多糖的蛋白脱除率为51.19%，多糖的保留率为49.99%。此时，树脂用量少，但是脱色率效果较好，且多糖率较高。综合来看，树脂D101的最佳用量为0.8g/mL。

图7 D101树脂用量对茶多糖蛋白脱除率的影响

当PHD500树脂在0.2-0.8g/mL时，随着树脂用量的增加蛋白脱除率在上升，多糖保留率在下降（见图8）。当树脂在0.2-0.4g/mL时，蛋白脱除率增加缓慢，多糖保留率下降明显。在0.4-0.8g/mL时，虽然蛋白脱除率增加快，但是多糖保留率低。当树脂用量在0.2g/mL时，乌龙茶多糖的蛋白脱除率为15.48%，多糖的保留率为66.86%。因此，树脂PHD500的最佳用量为0.2g/mL。

图8 PHD500树脂用量对茶多糖蛋白脱除率的影响

2.3 不同脱蛋白方法脱蛋白效果评价

以蛋白脱除率和多糖保留率为指标，比较四种脱蛋白方法。结果如表2，木瓜蛋白酶的蛋白脱除率低于AB-8树脂，多糖保留率高于D101树脂；AB-8树脂的蛋白脱除率最好，但是多糖保留率低于PHD500树脂（P＜0.05）；D101树脂的蛋白脱除率低于木瓜蛋白酶和AB-8树脂（P＜0.05），且D101树脂的多糖保留率最低（P＜0.05）；PHD500树脂的蛋白脱除率最低（P＜0.05），但是多糖保留率最好（P＜0.05）。从加权评分法分析可以看出AB-8树脂的评分最高。因此，选择AB-8树脂对乌龙茶多糖进行脱蛋白处理。

表2 4种脱蛋白方式脱蛋白结果比较

2.4 茶多糖化学成分分析结果

为确定乌龙茶多糖的理化指标，选取蛋白质、中性糖、和糖醛酸3个指标，计算各理化指标的含量(见表3)。由表3可知，乌龙茶多糖中蛋白质含量为18.04%，中性糖含量为33.23%，糖醛酸含量为39.35%，表明茶多糖中主要为中性糖和糖醛酸，并且含有蛋白质。

表3 乌龙茶多糖的化学成分

3 结论

本实验以脱色率和脱色率与多糖保留率为指标，通过比较4种脱色剂对乌龙茶多糖进行脱色，确定PHD500树脂的脱色率效果最好，脱色率效果评分最高；以蛋白脱除率和多糖保留率为指标，对4种脱蛋白方法进行比较，确定AB-8树脂的脱蛋白效果最好，蛋白脱除率效果评分最高。AB-8是弱极性树脂，比较适用于弱极性物质的提取分离和纯化，PHD500是极性树脂，面对极性大的物质吸附能力较强，而色素和蛋白的极性较强。综合考虑，选用AB-8为了提高脱色率、脱蛋白率的效果，节省材料，减少多糖损失率和简化工艺流程，确定采用AB-8树脂用于乌龙茶多糖脱色脱蛋白工艺，可以为乌龙茶多糖在分离纯化和结构鉴定等方面的进一步发展提供相应的技术支持。