牛大力黄酮类成分提取条件的优化

2020-05-18苏春蓝姚水莲卢海啸

质量安全与检验检测 2020年2期

勾玲唐珍苏春蓝姚水莲卢海啸*

（1.玉林师范学院广西玉林 537000；2.桂林旅游学院）

1 前言

牛大力是豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤Millettia Speciosa Champ.的干燥根[1]，俗称山莲藕、血藤、大力薯等。在两广地区广泛用作煲汤原料，是“舒筋健腰丸”“壮腰健肾丸”等十余种名优中成药的原料药[2，3]。而目前对牛大力的研究主要集中于栽培[4]、多糖提取[5]、药理活性[6]等方面，黄酮类成分加热回流提取方面尚未见报道。本文以芒柄花素含量[7]和浸膏得率为指标优选牛大力黄酮类成分的最佳提取条件，为提高牛大力黄酮提取效率提供参考。

2 材料、仪器与方法

2.1 材料与仪器

材料：牛大力药材饮片（广西泰嵘药业有限公司，170201）；芒柄花素标准品（上海源叶生物，F27J7S18516，纯度≥98%）；乙腈、甲醇（色谱纯）；冰已酸（分析纯）；乙醇（工业乙醇）。

仪器：高效液相色谱仪（岛津）；Inersustrain C18 柱；智能数显恒温水浴锅；电热恒温鼓风干燥箱；数控超声清洗器；循环水式多用真空泵；纯水机。

2.2 方法

2.2.1 芒柄花素含量的测定方法建立及结果

（1）色谱条件

Inersustrain C18 色谱柱，二极管阵列检测器（PDA），流动相比例为乙腈∶1%冰乙酸（37.2∶62.5），检测波长：260 nm，流速：1.5 mL/min，柱温：35℃，进样体积：10 μL。

（2）标准曲线绘制

精密称取芒柄花素标准品0.002 5 g，甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/ml 标准品溶液，采用（1）中色谱条件，改变进样量，设置连续自动进样量为 2、4、6、8、10、12 μL，以标准品各进样量所得峰面积为纵坐标（Y），以进样量为横坐标（X），进行线性回归，得到芒柄花素回归方程：Y=272625X+29687，R2=0.999 9。表明芒柄花素在该色谱条件下呈良好的线性关系，色谱图详见图1。

图1 芒柄花素标准品

（3）精密度试验

取（2）中标准品溶液，采用（1）中色谱条件，连续进样6 次，测得峰面积平均数为：2 749 491.17，标准方差为：5 820.43，相对标准偏差（RSD）为：0.20%，表明仪器精密性良好。同样的色谱条件下进行重复性试验、稳定性试验与加样回收率试验，RSD 均小于2.0%，方法重复性好，稳定性高。

2.2.2 制备供试品溶液制备方法

精密称取牛大力中粉（过药典4 号筛）1.001 6 g，加入50%工业乙醇10 mL，70℃水浴加热回流提取1 h，提取完冷却后补足损溶剂。滤纸过滤，取续滤液，过直径为0.22 μm 微孔滤膜置1.5 mL 取样瓶中，供试品中芒柄花素保留时间与对照品一致，出峰时间约在10.3 min。色谱图详见图2。

图2 供试品中的芒柄花素

（1）芒柄花素含量计算公式

其中，A供—供试品峰面积；A对—对照品峰面积；W—供试品重量，g。

（2）浸膏得率计算公式

其中，M1—干浸膏重量；M2—药材重量；V—提取液体积，mL。

2.2.3 牛大力提取的单因素试验方法

牛大力提取的单因素试验方法详见表1。

表1 单因素试验设计

3 结果和讨论

3.1 粒度对牛大力提取效果的影响

粒度对牛大力提取效果的影响显著，粗粉、中粉、细粉的浸膏得率（%）分别为 3.16±0.08、4.3±0.133、6.6±0.231，芒柄花素含量（μg/g）分别为 56.76±1.36、64.6±2.65、83.56±2.51。

由试验结果可知，颗粒越细，提取物的浸膏得率和芒柄花素含量越高。粗粉提取率和芒柄花素含量都较低，而细粉浸膏得率和芒柄花素含量都是最高的，提取时应选择细粉。

3.2 料液比对牛大力提取效果的影响

料液比对牛大力提取效果的影响结果详见表2。

表2 料液比对浸膏得率和芒柄花素含量的影响

由表2 可知，料液比越低，浸膏得率越大，且当料液比为1∶20 时，芒柄花素含量最高。同等条件下，粒度越细，提取溶剂与药材粉末的比表面积接触越大，提取越充分，料液比越低，溶解在提取剂中的物质比例越高。从本研究可以看出，粒度越小，料液比越低，提取物浸膏得率都呈明显上升趋势，当料液比较低时，增加了料液体系间有效成分的浓度差。考虑到降低能耗和功效成分的有效提取，选择细粉、1∶20料液比比较合适。

3.3 提取溶剂浓度对牛大力提取效果的影响

提取溶剂浓度对牛大力提取效果的影响结果详见表3。

表3 提取溶剂浓度对浸膏得率和芒柄花素含量的影响

由表3 可知，随着提取溶剂中乙醇含量的增加，提取浸膏得率逐步下降，而芒柄花素是先升高后急剧下降再升高的趋势，当使用90%工业已醇提取时，芒柄花素含量达到最大值。牛大力中含有丰富的多糖等水溶性物质，乙醇作为提取溶剂可以除去一些亲水性的黏液质、果胶、淀粉和部分多糖及其他水溶性杂质；在乙醇浓度40%～90%时，水溶性浸出物溶出减少，浸膏得率逐步降低，90%乙醇提取时芒柄花素含量是40%乙醇提取的将近1.5 倍。考虑到实际生产效率，选择80%乙醇进行提取较为合适。

3.4 提取温度对牛大力提取效果的影响

提取温度对牛大力提取效果的影响显著，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃时的浸膏得率（%）分别为 3.00±0.13、3.44±0.14、2.76±0.12、3.73±0.14、3.70±0.15，芒柄花素含量（μg/g）分别为 74.02±2.94、81.83±2.65、86.51±2.01、90.12±2.55、29.12±1.12。

随着提取温度的升高，浸膏得率呈现升高后降低再升高的趋势，芒柄花素含量在80℃前都呈缓慢上升趋势，90℃时急剧下降。表明不同的提取温度对牛大力中芒柄花素的提取有一定的影响，在50℃～80℃内，随着温度的升高，芒柄花素的含量呈上升趋势，在90℃时提取液中芒柄花素含量急剧下降，这可能是芒柄花素的酚羟基在高温下易被氧化[8，9]，导致部分芒柄花素结构受到破坏，因此提取温度应低于90℃。考虑到实际生产效率及可操作性，选择80℃作为提取温度比较合适。

3.5 提取次数对牛大力提取效果的影响

提取次数对牛大力提取效果的影响显著，1～5 次提取梯度中，浸膏得率（%）分别为 3.00±0.14、6.78±0.24、7.69±0.22、8.30±0.27、8.26±0.25，芒柄花素含量（μg/g）分别为 85.11±2.64、100.00±3.65、106.00±3.21、110.02±3.55、110.94±2.32。

随着提取次数的增加，浸膏得率和芒柄花素含量都逐步升高，在提取4 次与5 次时增幅较小，提取次数对浸膏得率和芒柄花素含量都有明显的影响，提取超过3 次后，升高趋势已不明显，说明原药材中芒柄花素等在提取3 次后已接近全部溶出。考虑生产效率和成本问题，选择提取2 次较为合适。

3.6 提取时间对牛大力提取效果的影响

提取时间对牛大力提取效果的影响显著，其中1、1.5、2、3、4 h 的浸膏得率（%）分别为 2.91±0.10、2.98±0.14、3.39±0.16、4.12±0.12、2.37±0.09，芒柄花素含量（μg/g）分别为 87.52±2.34、93.78±2.65、87.56±2.31、56.52±2.45、57.43±1.62。

随着提取时间的延长，浸膏得率在3 h 以前呈上升趋势，提取时间在4 h 时显著降低，而芒柄花素含量在1.5 h 提取时间时达到最高，提取时间在1～1.5 h时，芒柄花素含量逐渐增多，超过2 h 后芒柄花素含量急剧降低，可能是长时间高温加热状态下，芒柄花素的酚羟基被氧化从而造成提取液中芒柄花素含量降低。考虑生产效率和成本问题，选择提取时间为1.5 h较为合适。