一例猪伪狂犬病毒与大肠杆菌混合感染调查分析

莫云锋

（广西岑溪市马路镇水产畜牧兽医站 543202）

猪伪狂犬病毒是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘-带状病毒属的成员[1]，是危害全球养猪业的最为重要传染病之一，具有流行广泛、传播迅速、发病率与致死率高等特征[2]。早在1813年就有此病的报道，1910年Schmiedhoffer首次分离到该病毒。在我国，1947年刘永纯首次分离出PRV，1956年周圣文等人在哺乳猪中发现该病，自1979年确定为猪伪狂犬病以来，世界多个国家都有此病的爆发，给养殖业造成巨大的经济损失。猪伪狂犬病侵害不同年龄段的猪群，对2周龄内的仔猪危害最为严重，可达到100%。主要以高热、呼吸困难、震颤等症状为特征，成年猪以呼吸道症状为主，康复后的成年猪通常生长缓慢，严重制约我国养猪业的健康发展，造成的经济损失日趋严重[3]。

猪大肠杆菌病是一种革兰氏阴性短杆菌，是动物体内重要的肠道菌群，属于条件性致病菌，大多不致病，但某些血清型菌株的致病性较强，可引起腹泻，称为致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌是一种重要的人兽共患病原菌，其血清型较多，给防控带来一定的难度。猪大肠杆菌病是一种急性传染病，由致病性大肠杆菌引起，主要以腹泻为主[4]。猪感染大肠杆菌后发生腹泻，继而导致机体脱水，败血症或继发其他疫病，给养猪业带来严重影响。

1 材料

1.1 主要试剂和仪器

病毒DNA/RNA提取试剂盒、2×Taq MasterMix、DL 2000 DNA Marker均购自北京康为世纪生物科技有限公司；血平板培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；微量生化反应管和药敏纸片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。PCR仪、凝胶成像系统，购自Bio-rad公司。

1.2 样品来源

2019年10月广西某猪场育肥猪的脾脏、肺脏、脑、淋巴结等病料样品。PRV阳性疫苗保存于岑溪市动物疫病预防控制中心实验室。

2 诊断方法

2.1 临床症状及剖检变化

病猪出现精神不振，体温升高，呼吸急促，腹泻。对病死猪剖检可见，腹股沟淋巴结水肿，肝脏有白色坏死点，肺脏水肿，脾脏肿大，小肠系膜和胃浆膜有点状出血，胃底黏膜溃疡，胃肠黏膜呈现卡他性、出血性炎症变化。

2.2 细菌学检查

用接种环取淋巴结、脾脏和肺脏样品，采用平板划线法，接种在血琼脂培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中过夜培养18～24h后观察，并进行细菌形态学观察及鉴定。

2.3 药敏试验

采用K-B纸片法[5]，选用青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等10类共14种常用抗菌药物进行体外药敏试验。

2.4 病原检测

2.4.1 病料DNA的提取

无菌剪取病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结等病料样品放入研磨器中混均研磨，加入适量的灭菌生理盐水，-70℃反复冻融3次，8000r/min离心5min，取上清液，按病毒DNA/RNA提取试剂盒说明进行组织样品DNA的提取。提取的病毒核酸-20℃保存备用。

2.4.2 引物设计

扩增伪狂犬病毒gD基因中的基因片段，上游引物为PRVF（5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'）和下游引物为PRV-R（5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'）， 扩增长度 217bp。 引物由广州华大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR检测方法

PRV的反应体系为：2×Es Taq MasterMix 13μL，DNA模板3μL， 上游引物、 下游引物各 1μL， ddH2O 7μL， 总体系共25μL。瞬时离心混匀，反应程序为95℃ 1 min，55℃30s，72℃1min，35个循环后，72℃再延伸10min，12℃保存。

3 结果

3.1 细菌的鉴定

在血琼脂培养基平板上，淋巴结和脾脏均分离到细菌。经革兰氏染色后镜检可观察到革兰氏阴性杆菌。将单个菌落接种在麦康凯营养琼脂培养基上，结果细菌均生长出大肠杆菌特有的粉红色。进行生化试验发现此病原菌可以发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，MR试验阳性。VP试验阴性，动力试验阳性，吲哚试验阳性，不利用枸橼酸盐，也不产生H2S气体。经过以上鉴定可以确定该分离菌为大肠杆菌。

3.2 药敏试验结果

药敏试验结果可知 （附表），分离的大肠杆菌对头孢噻肟高度敏感，对阿米卡星、恩诺沙星、环丙沙星等中度敏感，对头孢拉定、庆大霉素、壮观霉素、罗红霉素、多西环素、诺氟沙星、阿莫西林、氨苄西林、克林霉素、林可霉素耐药。

3.3 PCR结果

通过PCR方法对病料样品和阳性样品分别进行检测。结果病料样品和阳性样品的片段大小均在217bp，表明该病料中PRV为阳性 （附图）。

4 预防及治疗

可采取以下措施预防该病的发生：及时隔离并治疗发病猪，对病死猪采取无害化处理，防止病毒和细菌大量繁殖扩散，对已经污染的圈舍、饲具和场地进行严格消毒。对病猪采用肌肉注射头孢噻呋、免疫球蛋白、转移因子等。对保育猪群进行肌注伪狂犬病毒疫苗，对哺乳仔猪用伪狂犬病毒疫苗滴鼻，猪群饲料中添加黄芪多糖、恩诺沙星，在饮水中添加多维。

5 讨论

当前，由于母猪大量使用疫苗，导致伪狂犬病发生于育肥猪的现象比较常见，伪狂犬的净化问题仍然是当前养猪业较为严重的问题之一[6]，因此，通过全群检测加淘汰野毒阳性猪的方法可以快速净化猪场。我国研究学者也加强了对不同地区猪伪狂犬病流行病学的监测，山东省猪伪狂犬病野毒抗体阳性感染率高达61.74%，福建省龙岩地区猪伪狂犬病野毒抗体的阳性感染率达30.41%，江苏地区猪伪狂犬病野毒抗体的阳性感染率达36%[7-9]。以上的流行病学调查结果表明，我国不同地区猪群中均存在一定的猪伪狂犬病流行，猪伪狂犬病感染情况比较普遍，不同地区感染率差异也较大，需要加强其控制和净化措施，制定科学合理的免疫程序，并加强该病综合防控十分必要。

目前临床上没有有效的疫苗来预防大肠杆菌病，采用抗菌药物防治仍是主要措施[10]。由于大肠杆菌易形成耐药性，特别是滥用抗菌药物，导致耐药菌株不断增加，在养殖生产中，抗菌药物常作为饲料添加剂用来预防和促进动物机体的生长，这些都导致了大肠杆菌耐药菌株的产生。因此，病猪治疗前应先对分离病菌进行药敏试验，根据试验结果选择敏感性抗生素用于治疗。同时应加强环境卫生的控制，及时清扫圈舍，保持猪舍卫生、干燥，使用适宜消毒液进行消毒，最好采取全进全出的饲养模式。