CBF在植物低温胁迫响应中的激活与调控研究进展

赵峻丽，陈 雯，石 敏

(浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300)

低温是严重影响作物生长发育乃至产量、品质的非生物胁迫之一。全球每年都有大批的农作物因遭受低温而大量减产，因此,植物如何抵御低温胁迫成为研究热点。当植物受到外界低温刺激时，COR(Cold regulated)基因被激活并表达，从而提高植物对低温的耐受力。通过对模式植物拟南芥COR基因启动子区域顺式作用元件分析，鉴别出一个9 bp的DRE元件(Dehydration responsive element)，该元件能够对脱水、盐和低温产生反应[1]，其核心序列为CCGAC，称为CRT(C-repeat)，能够被低温诱导[2]。植物中存在2条低温胁迫响应调控途径，即ABA依赖型与非ABA依赖型调控途径，而非ABA依赖型调控途径又可分为依赖于CBF(C-repeat binding transcription factor)的调控途径和不依赖于CBF的调控途径[3]。不依赖于CBF的调控途径包括ROS-bZIP-CRT/DRE (Reactive oxygen species-basic leucine zipper-CRT/DRE)和MYC/MYB(Myelocytomatosis related protein/myeloblastosis retated protein)-MYCRE/MYBRE 2条途径[4]。近年来，对依赖于CBF的调控途径的研究最多。CBF属于AP2/ERF(APETALA2/ethylene response protein)类家族的转录因子，也被称为DREB (Dehydration responsive element binding protein),在植物响应低温胁迫中起着重要的作用[5-6]。CBF通过结合抗冻相关基因启动子区域的顺式作用元件，从而调节抗冻相关基因的表达，如COR47、COR15a、COR78、COR6.6等，以此提高植物的抗冻性[7]。目前，最经典的低温反应通路是ICE1 (Inducer of CBF expression 1)-CBF-COR通路。在该通路中，ICE1的降解通过HOS1 (High osmotic expression 1)所介导的泛素化途径进行,HOS1在拟南芥中是一个E3泛素化连接酶，当植物受到低温胁迫时，HOS1通过与ICE1互作导致ICE1降解，抑制CBF及其下游基因的表达，从而调控植物的耐冷性[8]。对CBF基因的功能及其调控基因、调控CBF的上游基因及植物激素与CBF互作等方面进行综述，并展望了CBF在农业生产上的应用前景，以期为深入研究CBF的耐冷机制奠定基础，为利用基因工程技术培育耐冷作物品种提供参考。

1 植物中CBF基因的功能及其调控的下游基因

目前，对CBF基因功能的研究很多[3]。低温处理cbf1/2/3三突变体拟南芥幼苗，发现三突变体比单突变体对低温的敏感性更强[9-10]。CBF基因在常温条件下表达量很低，但是低温刺激下表达量在几分钟之内迅速升高，经过几小时后恢复到原始水平[6,11-12]。植物中CBF对下游基因的调控主要表现在影响植物的耐冷性方面， CBF主要调控COR基因发挥其功能，其中对COR15a基因的研究较深入，COR15a基因在植物体中具有保护叶绿体以及原生质体的作用[13-14]。除COR基因,研究还发现，CBF可激活RAP2.6(Related to APETALA 2.6)和RAP2.1基因[15]。前人研究发现，COR78和rd29A、COR47和rd17分别是同一个基因，同时发现在油菜(Brassicanapus)中Bn115和Bn28、小麦中Wcs120(Wheat cold acclimation 50 ku protein 120)和Wcs200也受低温诱导表达[15]，并且这些基因中的启动子区域与COR基因一样都含有CRT/DRE结合元件，CBF能够与之结合从而促进其表达。CBF基因除了主要参与低温胁迫响应外，还参与干旱、高盐胁迫响应[16-18]。

2 植物中调控CBF基因的相关蛋白研究进展

在之前的研究中，对于CBF基因的上游研究较多，在正常温度下，CBF表达维持在低水平，使植株正常生长；在低温下，CBF可以被一些转录因子、蛋白激酶调控表达，响应低温胁迫[19]。

2.1 调控CBF基因的转录因子

CBF基因家族在拟南芥中有CBF1—CBF3三个成员，均位于4号染色体上[11-12]。研究表明cbf1、cbf2、cbf3对低温呈现出敏感性[9-10]。在拟南芥CBF调控网络中，ICE1为bHLH( Basic helix-loop-helix)家族中的转录因子，能够与CBF启动子上的MYC结合元件结合并促进其表达[20-21]，参与CBF-COR抗冻调控网络，形成ICE1-CBF-COR信号通路。除了ICE1，其他转录因子也可以与CBF启动子序列结合并且调控其表达。CBF启动子中含多个MYB结合序列，表明CBF基因的表达可能受MYB转录因子调控。研究表明，myb15缺失突变体中CBF的表达水平显著升高，突变体对于低温的耐受性也显著增强；进一步研究发现，MYB15与CBF启动子直接结合并负调控CBF的表达[22]。类似的，MYB3在正常条件下直接与CBF4启动子结合并且抑制其表达；低温可直接诱导MYB61基因表达，其通过抑制MYB3与CBF4的结合而增强CBF4的转录，从而提高植物对低温的耐受性[23]。MYB31在低温下可促进CBF基因的表达，增强植物对低温和氧化应激的抵抗力[24]。

植物色素、红光与远红光的比例与植物的冷驯化和低温耐受性相关[25-27]。光敏色素B以及2个光敏色素相互作用因子(Phytochrome-interacting factors，PIF)PIF4和PIF7在长日照条件下会抑制CBF表达[26]。PIF3与CBF启动子的上G-box和E-box结合，在黑暗与低温条件下抑制CBF的转录，从而降低植物对低温的耐受性[26]。另外，研究发现，红光与远红光比例较低时能增加CBF基因表达量[27]。

2.2 调控CBF基因的蛋白激酶

在植物体中，蛋白质修饰会影响蛋白质的活性、定位及稳定性等[28]。目前，已发现多个蛋白质修饰类型参与低温胁迫响应，主要包括泛素化、磷酸化修饰等[29-30]。研究发现，ICE1蛋白能够与HOS1(High expression of osmotically responsive gene 1)、SIZ1(SUMO-protein ligase)、OST1(Open stomata 1)、MPK3(Mitogen-activated protein kinases 3)、MPK6以及 BTF3(Basic transcription factor 3)等蛋白质相互作用调控CBF的表达[8，20，31]。植物体中HOS1通过对ICE1进行泛素化降解破坏ICE1的稳定性从而导致下游的CBF表达量降低，属于负调控因子[8]。SIZ1是一个泛素化连接酶，介导ICE1的泛素化修饰而增加它的稳定性，并降低HOS1对ICE1的泛素化作用[31]。

蛋白质磷酸化在植物响应低温胁迫中也具有重要作用[28]。在植物中，OST1是ABA信号途径中的蛋白激酶[32]，通过磷酸化修饰ICE1抑制HOS1对ICE1的26S蛋白酶体所介导的泛素化降解[33]。EGR2 (E growth-regulating 2)磷酸酶通过抑制OST1激酶活性从而降低植物的低温耐受能力[34]。MAPK信号级联对于低温的耐受性主要通过ICE1-CBF-COR信号通路发挥作用[35-36]。在植物中,MAP3K受到刺激后激活质膜受体，激活的MAP3K磷酸化MAP2K，MAP2K的磷酸化激活MAPK[37]。MAPK对调节植物低温耐受性具有积极的作用[38]。植物中MPK4和MPK6在低温下能被诱导表达[39-40]；MKK2也在低温下能够被激活，且进一步激活MPK4和MPK6[38]。MPK3/MPK6使ICE1磷酸化并且抑制它的转录活性，进而ICE1被泛素化降解，引起CBF基因的表达量下降，导致植物对低温的耐受性降低[36]。

3 植物激素参与CBF途径的研究进展

研究表明，乙烯的缺失会降低番茄的低温耐受性，但是乙烯利处理能够提高番茄的低温耐受性[41]；而抑制乙烯的生物合成通路下调了番茄CBF1基因的表达，降低了番茄的低温耐受能力，表明乙烯的生物合成通路能够正向调控番茄的低温耐受能力[42]。过表达SlERF2(Solanumlycopersicumethylene response factor 2)能够增强转基因烟草和番茄植株的低温耐受能力，SlERF2沉默表达出现相反的结果[43]。EIN3 (Ethylene insensitive 3)对于植物的低温耐受性起负调控作用，其能够与CBF启动子区的EBS(Ets-binding site)结合，从而影响CBF的表达[44]。EBF1/2(EIN3-binding F-BOX 1/2)是乙烯信号通路中的2个F-box蛋白，通过抑制EIN3和PIF3的表达而正向调控CBF的表达[27,44]。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)是影响许多植物生理过程的一类激素，也参与植物冷胁迫响应。HAN1(Han termed chilling in Chinese)编码1个氧化酶，通过代谢的方法激活茉莉酸在植物生长发育与逆境胁迫过程中发挥作用，还可阻止低温条件下茉莉酸的过度积累，使植物在恢复正常条件后能够正常生长。正常条件下，han1缺失突变体的生长速率与野生型相比明显受到了抑制；但是在低温条件下，缺失突变体的存活率明显高于野生型，而HAN1过表达植株在低温条件下耐受性明显低于野生型[45]。茉莉酸能够调节ICE1与JAZ1/4(Jasmonate zim-domain protein 1/4)蛋白的互作，进而调控CBF的表达[46]。使用外源茉莉酸甲酯可以提高苹果中冷胁迫响应基因bHLH1、CBF1、CBF2和CBF3的表达水平，从而增强苹果的低温耐受性[47]。

植物类固醇激素，如BR(Brassinosteroids)，也在提高低温耐受性方面发挥作用[48]。BIN2(Brassinosteroid insensitive 2)是一种参与BR信号的蛋白激酶，介导PIF3的磷酸化和降解[49]。BR不存在的情况下，BIN2活化2个同源转录因子BZR1(Brassinazole-resistant 1)和BES1(BRI1-EMS-suppressor 1)，从而促进BZR1与BES1的降解；BR存在的情况下，BIN2被BSU1( BRI1 suppressor 1)去磷酸化以及被26S蛋白酶体降解，随后释放BZR1和BES1，解除BIN2对BZR1和BES1的抑制作用[50-52]，BZR1和BES1去磷酸化积累在细胞核内[51,53-54]。低温胁迫响应中，BIN2以及其同系物起负调控作用，然而BZR1和BES1有正向调节低温胁迫响应的作用，BZR1通过与CBF1/CBF2的启动子直接结合来提高CBF的表达，从而提高植物对低温的耐受性[55]。

SA(Salicylic acid)是一种重要的植物抗病性激素。研究表明，SA受体NPR1(Non expressor of pathogenesis-related gene 1)在植物的低温响应中发挥重要的作用，低温诱导胞质NPR1进入细胞核内，SA在抵御病原体的反应中也是如此[56-57]，此发现表明病原体抵御反应和低温响应反应机制中有许多相通的部分。同样的蛋白质(NPR1)通过改变自身的构象来感知低温和病原体信号[58]，然而其在不同的应激条件下是如何被调控的，需要进一步深入研究。

4 展望

低温对农作物的生长发育以及农作物的种植分布有着巨大的影响，但是当农作物遭受低温胁迫时，机体会对外界刺激做出应答，防御低温伤害，其调控网络错综复杂。前人在低温响应机制的研究中取得了开创性的进展。在低温胁迫响应中，除了CBF通路的参与，还有许多转录因子参与低温胁迫响应。之前大多数研究都是围绕ICE1进行，但是根据新的研究发现，CBF蛋白能被26S蛋白酶体降解，说明有1个未知的E3连接酶参与这条途径并发挥功能，目前并不明确，因此需要对其进行更深入的研究[19]。