一株小核菌多糖高产菌及其发酵特征

张永刚，董学前，王 伟，张艳敏

(山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013)

一株小核菌多糖高产菌及其发酵特征

张永刚，董学前*，王 伟，张艳敏

(山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013)

从感染白腐病的马铃薯中分离筛选了一株高产小核菌多糖菌株，命名为齐整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)，对菌株SCL2010发酵培养基的碳源、有机氮源进行优化，并对发酵过程中pH值的变化进行了研究。结果表明，以葡萄糖为碳源、玉米浆为有机氮源对菌株SCL2010进行发酵，小核菌多糖的产量、碳源转化率和产物合成速率分别达到28 g·L-1、56%和0.39 g·L-1·h-1，显著高于已有研究报道。在发酵产小核菌多糖的过程中，其pH值的变化与已有研究报道显著不同：其pH值从发酵开始迅速下降至3.0以下后开始缓慢上升至3.5～4.0；如果控制pH值则使小核菌多糖的产量显著降低，而草酸含量升高，以此推测小核菌多糖的合成可能与pH值的变化有关，后续将进行深入研究。

小核菌多糖；齐整小核菌；高产菌株；发酵特征

小核菌多糖(scleroglucan)是由丝状真菌齐整小核菌产生的非离子水溶性胞外多糖。其分子由含有β-D-(1,6)-葡萄糖残基侧链的线性β-D-(1，3)-葡萄糖残基链组成。小核菌多糖具有良好的流变性、耐酸碱(pH 1～12)、矿化度适应性强(0～200 000 mg·L-1)、耐高温(130 ℃)[1-2]，在食品与石油工业具有潜在的应用价值。小核菌多糖能提高原油采收率，在当前普遍进入三次、四次采油的趋势下，具有广阔的市场前景。但是小核菌多糖的产量不高使其价格居高不下，严重限制了其市场发展。因此，提高小核菌多糖的产量是目前的研究重点。目前，主要通过优化培养基、发酵条件、发酵罐设计以及高产菌株诱变等方法实现小核菌多糖高产的目的[3]。

从感染白腐病的马铃薯中分离筛选出一株显著高产小核菌多糖的丝状真菌，通过18S rDNA序列比对分析，该菌株属于齐整小核菌，命名为齐整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)。为提高小核菌多糖的发酵产量，对菌株SCL2010发酵培养基的碳源和有机氮源进行了优化，并研究了该菌株发酵过程中pH值的变化规律。

1 实验

1.1 菌种和培养基

齐整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010),保藏于中国典型微生物保藏中心(CCTCC No.M 2014325)。

基本发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖50.0，酵母膏2.0，NaNO32.0，K2HPO4·3H2O 1.0，柠檬酸0.7，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，pH值4.5。

1.2 方法

1.2.1 发酵过程

摇瓶发酵：500 mL摇瓶装液量80 mL，接种量10%，发酵温度28 ℃，摇床转速300 r·min-1。

10 L发酵罐发酵：装液量7 L，接种量10%，发酵温度28 ℃，搅拌转速350 r·min-1。

1.2.2 小核菌多糖产量和生物量的测定

取10 mL发酵液中和，用蒸馏水稀释3～4倍，80 ℃水浴30 min，均质1～2 min后10 000g离心30 min。上清液加2倍体积的95%乙醇沉淀小核菌多糖，过滤，再用95%乙醇洗涤，所得沉淀于105 ℃干燥，称重，测定小核菌多糖产量。离心所得沉淀用蒸馏水重溶洗涤后10 000g离心30 min，所得沉淀于105 ℃干燥，称重即为生物量。

1.2.3 发酵液表观黏度与1.0%(质量体积比，下同)多糖溶液黏度的测定

发酵液表观黏度采用NDJ-1型黏度计、4号转子、60 r·min-1、25 ℃测定。

1.0%多糖溶液黏度采用NDJ-1型黏度计、3号转子、60 r·min-1、25 ℃测定。

1.2.4 发酵液残糖含量的测定

采用费林法测定以淀粉和葡萄糖为碳源时的残糖含量。采用紫外分光光度法测定以蔗糖为碳源时的残糖含量。

1.2.5 发酵液草酸含量的测定(HPLC法)

色谱条件：Shimadzu/Agilent 1100 液相分析系统，G1311A 四元泵，示差折光检测器(RID)，进样量为10 μL；Agilent HPLC 2D色谱工作站；色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H多孔阴离子交换柱(7.8 mm×300 mm)，柱温为55 ℃，流动相为10 mmol·L-1H2SO4，流速为0.4 mL·min-1。以保留时间定性，外标法定量。

样品处理：沸水浴10 min，12 000g离心10 min，经0.22 μm水相滤膜过滤。

2 结果与讨论

目前关于小核菌多糖发酵生产的相关研究所采用的菌株主要有SclerotiumrolfsiiATCC 201126、ATCC 15205、MTCC 2156，发酵培养基成分基本相同，碳源为蔗糖，有机氮源为酵母膏，发酵产量多在20 g·L-1左右[4-6]。

2.1 碳源对发酵产小核菌多糖的影响

分别采用淀粉、蔗糖、葡萄糖作为菌株发酵培养基的碳源，浓度均为50 g·L-1，发酵时间为72 h，结果见图1。

图1 碳源对发酵产小核菌多糖的影响Fig.1 Effect of carbon source on fermentativescleroglucan production

由图1可以看出，以淀粉为碳源时，小核菌多糖的产量高达30 g·L-1，但产生的多糖黏度较低，即平均分子量低，分子链短；以葡萄糖为碳源时，小核菌多糖的产量(28 g·L-1)和黏度都较高；而以蔗糖为碳源时,多糖产量较低，仅为22 g·L-1左右，这与目前大量以蔗糖为碳源发酵产小核菌多糖的研究结果基本吻合。Faria等[4]采用150 g·L-1蔗糖为碳源，小核菌多糖的产量达到28 g·L-1，虽然产量高但碳源转化率远低于本研究中以淀粉和葡萄糖为碳源的碳源转化率。综合考虑，选择适宜碳源为葡萄糖。

进一步研究葡萄糖浓度对发酵产小核菌多糖的影响，结果见图2。

由图2可以看出，随着葡萄糖浓度的增大，小核菌多糖产量呈上升趋势，但当葡萄糖浓度超过50 g·L-1后，碳源转化率开始下降，残糖含量上升显著。因此，该菌株发酵产小核菌多糖适宜碳源浓度为50 g·L-1，小核菌多糖产量达到28 g·L-1以上，碳源转化率达到56%。

图2 葡萄糖浓度对发酵产小核菌多糖的影响Fig.2 Effect of glucose concentration onfermentative scleroglucan production

2.2 有机氮源对发酵产小核菌多糖的影响

分别采用酵母膏、玉米浆、蛋白胨、大豆蛋白胨、水解豆粉作为菌株发酵培养基的有机氮源，浓度均为1 g·L-1，发酵时间为72 h，结果见图3。

图3 有机氮源对发酵产小核菌多糖的影响Fig.3 Effect of organic nitrogen source onfermentative scleroglucan production

由图3可以看出，以玉米浆为有机氮源时，小核菌多糖产量和菌体生物量均高于其它4种有机氮源，而有机氮源的种类对1.0%多糖溶液的黏度影响并不明显，即不影响产品质量。综合考虑，选择适宜的有机氮源为玉米浆。

进一步研究玉米浆浓度对发酵产小核菌多糖的影响，结果见图4。

从图4可以看出，随着玉米浆浓度的增大，菌体生物量呈上升趋势；小核菌多糖产量在玉米浆浓度超过1.0 g·L-1后变化不明显；当玉米浆浓度超过2.0 g·L-1后，小核菌多糖的产量开始下降。因此，玉米浆适宜浓度为1.0 g·L-1。

图4 玉米浆浓度对发酵产小核菌多糖的影响Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration onfermentative scleroglucan production

2.3 发酵特征

图5、6为菌株SCL2010的10 L发酵罐发酵过程曲线。

图5 发酵产小核菌多糖过程中生物量、残糖含量和多糖产量变化Fig.5 Changes of biomass，residual sugar content,and polysaccharide production in the process offermentative scleroglucon production

图6 发酵产小核菌多糖过程中pH值、发酵液表观黏度和草酸含量变化Fig.6 Changes of pH value,fermentation broth viscosity,and oxalic acid content in the process offermentative scleroglucan production

从图5、6可以看出，小核菌多糖与菌株的生长具有一定相关性，在发酵前期(0～24 h)pH值迅速降低，但小核菌多糖产量和生物量增加缓慢，葡萄糖消耗速率较慢；到发酵中期(24～56 h)后，小核菌多糖产量和生物量迅速增加，葡萄糖迅速消耗，草酸大量生成，但pH值上升缓慢，发酵液表观黏度随着小核菌多糖的积累迅速上升；在发酵后期各参数变化趋缓。小核菌多糖的最高产量(28 g·L-1)显著高于已有研究报道。大量研究表明[4-6]，发酵产小核菌多糖的过程中pH值的自然变化是由初始4.5逐渐降低至2.0左右；但在菌株SCL2010发酵产小核菌多糖过程中，pH值下降至2.8(30 h)左右后，开始缓慢回升，直至发酵结束，可达到3.8左右(图6)。菌株SCL2010发酵过程中pH值的变化和其它菌株显著不同，推测这一独特的pH值变化过程可能是该菌株高产小核菌多糖的主要原因。

2.4 pH值变化与小核菌多糖的高产

pH值对菌体内生物酶的活性影响显著。在小核菌多糖发酵过程中pH值对菌体生长和小核菌多糖的生物合成均有显著影响。有研究表明pH值为2时对菌体生长有利，而pH值为4.5时对小核菌多糖的生物合成具有促进效果[7]。在pH值上升期，控制发酵液pH值维持在不同值(2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0)，以pH值自然变化作为对照，考察pH值对发酵产小核菌多糖的影响，结果见图7。

图7 不同pH值对发酵产小核菌多糖的影响Fig.7 Effect of different pH values onfermentative scleroglucan production

由图7可以看出，pH值在3.5和3.8时小核菌多糖产量较高，但仍低于自然pH值变化的发酵产量水平，且合成了较多的草酸。原因有待于通过代谢流分

析实验进一步研究。

3 结论

菌株SclerotiumrolfsiiSCL2010是具有显著特异性的小核菌多糖高产菌，其发酵适宜的碳源和有机氮源分别为葡萄糖和玉米浆。发酵过程的最显著特征是pH值在发酵前期迅速降至3.0以下，而在进入产糖期后则开始逐渐回升至3.5～4.0，小核菌多糖产量可达28 g·L-1。后续将通过菌株发酵过程中代谢流的变化特征的研究，分析该pH值变化规律的机理，以阐释pH值变化与该菌株高产小核菌多糖的关系。

[3] SCHMID J,MEYER V,SIEBER V.Scleroglucan：biosynthesis，production and application of a versatile hydrocolloid[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91(4):937-947.

[5] SCHILLING B M,RAU U,MAIER T，et al.Modeling and scale-up of the unsterile scleroglucan production process withSclerotiumrolfsiiATCC 15205[J].Bioprocess Engineering，1999,20(3)：195-201.

[6] SURVASE S A,SAUDAGAR P S,SINGHAL R S.Use of complex media for the production of scleroglucan bySclerotiumrolfsiiMTCC 2156[J].Bioresource Technology，2007，98(7):1509-1512.

AScleroglucanHigh-YieldingStrainandItsFermentationCharacteristics

ZHANG Yong-gang，DONG Xue-qian*，WANG Wei，ZHANG Yan-min

(ShandongFoodFermentIndustryResearchamp;DesignInstitute,Jinan250013，China)

We isolated a scleroglucan high-yielding strain namedSclerotiumrolfsiiSCL2010 from potatoes suffered white rot,optimized carbon source and organic nitrogen source of fermentation medium,and investigated pH value change in the fermentation process.The results showed that，in the fermentation with glucose as a carbon source and corn steep liquor as a nitrogen source，scleroglucan yield，nitrogen source conversion rate，and product synthetic rate were 28 g·L-1,56%,and 0.39 g·L-1·h-1,respectively，which were significantly higher than those of previous studies.Different from the previous studies，the pH value dropped to below 3.0 at the initial stage while rose slowly to 3.5～4.0.When the pH value was controlled at a certain value，the scleroglucan production decreased significantly but the oxalic acid content increased，which revealed the scleroglucan synthesis might be associated with the pH value change,and further study is required.

scleroglucan;Sclerotiumrolfsii;high-yielding strain;fermentation characteristics

山东省重点研发计划项目(2015GGX102015)

2017-07-03

张永刚(1985-)，男，内蒙古突泉人，工程师，研究方向：微生物聚合物发酵生产技术与产业化应用,E-mail：zyg8500@126.com；通讯作者：董学前，研究员,E-mail：dxqn@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.005

张永刚，董学前，王伟，等.一株小核菌多糖高产菌及其发酵特征[J].化学与生物工程，2017，34(11)：19-22.

TQ922

A

1672-5425(2017)11-0019-04