漏芦对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因表达的影响

刘莉莉，杨炳友

(黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

乳营养品质低下对我国奶业造成了严重的影响，已成为我国奶业健康发展面临的主要问题。乳蛋白作为乳营养品质的主要物质基础，是一种营养价值很高的蛋白质，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，也是乳腺上皮细胞分泌的特有的磷酸化蛋白。酪蛋白主要分为4种：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白。乳汁中αs-酪蛋白通常以多重磷酸化的形式存在，β-酪蛋白是乳中主要的酪蛋白，κ-酪蛋白是唯一含有乳糖成分的酪蛋白，起到稳定酪蛋白微团的作用[1]。酪蛋白的分泌水平在一定程度上反映了产奶动物乳腺上皮细胞的泌乳能力[2]，故研究乳腺上皮细胞的泌乳功能常将酪蛋白作为一个评判指标。酪蛋白也是羊乳乳汁中的主要成分，不仅为山羊机体提供了丰富的氨基酸，而且还是生物活性肽的一种重要来源[3]。乳腺上皮细胞内酪蛋白的合成主要受2条信号通路调控：JAK-STAT5 信号通路和mTOR信号通路[4]。JAK2-STAT5是在转录水平上调节乳蛋白合成的重要信号通路[5]。mTOR是在翻译水平调节乳蛋白合成的重要信号通路。mTOR主要通过调节其下游的2个靶因子，即S6K1以及 4EBP1发挥调节作用[6]。

在食品安全问题日益重视的今天，激素类及抗生素类药物在畜牧业生产上的使用备受争议，而中药源自天然，并具有毒副作用小、不产生抗药性等优点，用于泌乳动物增乳有其独特优势[7-8]。郑涛等[9]利用中药通草处理乳腺上皮细胞，发现通草可以提高小鼠乳腺上皮细胞的泌乳量及乳中蛋白含量。孟海洋[10]证实，王不留行可以调控奶牛乳腺上皮细胞磷酸化mTOR和磷酸化STAT5等信号分子表达。

漏芦来源于菊科植物祁州漏芦[Rhaponticumuniflorum(L.) DC.]的干燥根，具有清热、解毒、消痈、除肿等功效。含有漏芦的复方中药制剂能治疗动物产后缺乳及促进产奶动物泌乳[11-12]，但有关漏芦对奶山羊乳腺酪蛋白的合成及酪蛋白合成相关基因表达的影响国内外尚未见报道。羊奶具有极其重要的营养价值，以奶山羊乳腺上皮细胞为模型，研究不同水平的漏芦乙醇提取物对乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及酪蛋白合成相关基因表达的影响，旨在为进一步研究漏芦对泌乳动物乳腺酪蛋白合成的调控机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

中药漏芦购自黑龙江省药材公司，由黑龙江中医药大学于丹副教授鉴定为菊科药用植物祁州漏芦[Rhaponticumuniflorum(L.)DC.]的干燥根。奶山羊乳腺上皮细胞由东北农业大学动物生物化学教研室提供。

1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、优质胎牛血清购自Gibco公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒(Prime Script RT Reagent Kit)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(SYBR Primx ExTaq)购自TaKaRa公司。

1.3 漏芦乙醇提取物的制备

将500 g祁州漏芦切碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并滤液，经减压浓缩即得漏芦乙醇提取物，得率为8.9%。使用前先用少量DMSO助溶，再用完全培养基配成试验所需质量浓度，过滤除杂除菌备用。

1.4 奶山羊乳腺上皮细胞培养

采用生长培养基(DMEM/F12+10%FBS)于37 ℃、5% CO2条件下培养奶山羊乳腺上皮细胞，每隔24 h更换新鲜培养基。

1.5 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力影响的测定

将对数生长期的奶山羊乳腺上皮细胞接种于48孔细胞培养板中，待细胞融合度达到70%～80%时，更换新鲜培养基。对照组细胞添加正常细胞培养基，各处理组细胞在添加正常细胞培养基的基础上，同时添加不同剂量(质量浓度分别为25、50、100、200、400、600、800 μg/mL)的漏芦乙醇提取物，每组5 个平行。细胞培养48 h，消化不同试验组的乳腺上皮细胞，制成单细胞悬液，加入CASY 杯中，用 CASY 缓冲液对细胞悬液进行1∶1 000倍稀释，利用CASY细胞活力分析仪测定细胞活力及增殖能力[13]。

1.6 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因表达影响的检测

将处于对数生长期的奶山羊乳腺上皮细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合度达到70%～80%时，更换新鲜培养基，对照组细胞添加正常细胞培养基，各试验组细胞在添加正常细胞培养基的基础上，同时添加不同剂量(质量浓度分别为25、50、100 μg/mL)的漏芦乙醇提取物，每个处理5个平行。漏芦乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮细胞48 h，收集细胞，TRizol法提取奶山羊乳腺上皮细胞RNA，根据反转录试剂盒(Prime Script RT Reagent Kit)说明书进行反转录，将总RNA反转录为 cDNA，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(SYBR Primx ExTaq)检测奶山羊乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1和S6K1基因的mRNA表达水平。 试验所用基因的引物序列见表1，选用β-actin作为内参基因。采用 2-ΔΔCT相对定量的方法计算目的基因的mRNA表达丰度[13]。

表1 qRT-PCR中基因引物序列Tab.1 Sequences of gene primers for qRT-PCR

1.7 数据处理

试验数据均以平均数±标准差表示；采用SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力影响的试验结果见图1和图2。与未添加漏芦乙醇提取物的对照组相比，25、50、100 μg/mL漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞活力和增殖能力无显著性变化(P>0.05)；而较高剂量(200～800 μg/mL)的漏芦乙醇提取物明显抑制了细胞的活力和增殖能力(P<0.05)。故本试验后续选择不抑制细胞生长增殖的添加质量浓度(25、50、100 μg/mL)，研究漏芦对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因表达的影响。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同 The different lowercase letters show significant differences(P<0.05).The same below图1 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞活力的影响Fig.1 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the viability of mammary epithelial cells in dairy goat

图2 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞增殖能力的影响Fig.2 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the proliferation ability of mammary epithelial cells in dairy goat

2.2 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3mRNA表达水平影响如图3所示。与对照组细胞相比，漏芦乙醇提取物(25、50、100 μg/mL)以剂量依赖的方式明显促进乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3酪蛋白基因的mRNA表达(P<0.05)。

2.3 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因mRNA表达的影响

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1、S6K1mRNA表达水平影响如图4所示。与对照组相比，25、50、100 μg/mL漏芦乙醇提取物同样以剂量依赖的方式显著上调酪蛋白合成相关基因STAT5、JAK2、mTOR、S6K1的mRNA表达水平(P<0.05)，以剂量依赖方式显著抑制4EBP1基因的mRNA表达(P<0.05)。

图3 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响Fig.3 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the mRNA expression of casein genes of mammary epithelial cells in dairy goat

3 结论与讨论

动物乳腺的基本组成单位是上皮细胞，其活力和数量能影响乳腺的泌乳量。高云航等[18]将不同方法提取的复方中药提取物体外作用于小鼠乳腺上皮细胞，结果显示，适当剂量的中药复方提取物可促进细胞增殖。孟海洋[10]利用王不留行提取液处理奶牛乳腺上皮细胞，发现其能显著提高乳腺细胞的活力及增殖能力。周凡[19]研究表明，单味中药重楼、泽兰叶、半枝莲在适当的药量下能促进小鼠乳腺上皮细胞增殖，但药物剂量过高或作用时间过长会抑制乳腺细胞活力。本试验结果表明，较高剂量(200～800 μg/mL)漏芦乙醇提取物抑制了奶山羊乳腺上皮细胞的活力和增殖能力，而低剂量(25～100 μg/mL)的漏芦乙醇提取物对乳腺细胞活力和增殖能力无明显的影响，这为后续试验摸索出适当的药物添加剂量，即选取对乳腺细胞无抑制作用的添加剂量(25～100 μg/mL)进行研究，但漏芦对乳腺上皮细胞活力影响的机制还有待进一步研究。

前人研究发现，一些中药复方灌注液或单味中药提取物能促进乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。罗莹[20]报道，采用适宜剂量的紫花地丁、黄芪、泽兰、诃子中药提取物处理奶牛乳腺上皮细胞，可以显著促进β-酪蛋白的分泌。刘杰等[21]研究表明，甲珠、蒲公英水煎剂能以一定剂量依赖效应提高奶牛乳腺细胞β-酪蛋白和乳糖的分泌。毛智斌等[22]发现，葎草黄酮作用的奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达量明显上调。但前人研究多数集中于中药对乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白能力的影响，而对其他酪蛋白基因表达能力的影响却鲜有报道。本研究检测了漏芦乙醇提取物体外作用奶山羊乳腺细胞后，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3等4种酪蛋白基因mRNA的表达水平，发现漏芦不仅能明显促进CSN2基因的mRNA表达，而且也显著上调其他酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2和CSN3mRNA的表达水平。

乳腺乳蛋白合成的一条信号转导通路是JAK2-STAT5通路，当乳腺细胞中催乳素等配体与其受体结合后，诱导受体二聚体化并激活JAK2。然后，JAK2使转录因子STAT5磷酸化，STAT5被激活并形成单体或多聚体转位到细胞核中，与目的基因的启动子区域特异性结合以激活转录，该通路对乳腺中乳蛋白的合成及相关基因的转录有激活作用[23]。李萌等[24]报道，王不留行活性成分可能通过激活催乳素受体，进而激活STAT5信号转导途径，促进其下游β-酪蛋白相关基因的表达。郑涛等[9]发现，通草可能通过增强小鼠乳腺上皮细胞转录激活因子STAT5的磷酸化水平，从而促进小鼠乳汁分泌。本试验结果显示，漏芦乙醇提取物除能促进奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白基因的mRNA表达，该提取物也能以剂量依赖方式显著提高乳腺细胞JAK2-STAT5通路关键信号分子JAK2和STAT5的mRNA表达。推测中药漏芦所含活性成分可能发挥一定的类雌激素作用，进而调节其他泌乳相关激素如催乳素而激活JAK2-STAT5通路；或者漏芦能促进催乳素与其受体结合，进而激活JAK2并进一步活化STAT5，被激活的STAT5进入奶山羊乳腺细胞核启动其下游乳蛋白合成相关基因的转录激活。

乳蛋白合成的另一条信号通路是mTOR通路，其下游S6K1、4EBP1蛋白的磷酸化水平增强能调节反刍动物乳腺上皮细胞乳蛋白合成[25]。S6K1可激活核糖体S6蛋白，S6蛋白能提高5′端含寡聚嘧啶的mRNA翻译效率[26]。研究发现，S6K1在细胞增殖及周期进程中具有重要调节作用，它的活性可被mTOR上调[27]，但mTOR对4EBP1表达起负调节作用[28]。王不留行水浸提液可以提高奶牛乳腺上皮细胞磷酸化STAT5、S6K1及磷酸化mTOR的表达，进而促进乳蛋白合成[19]。本试验结果也表明，漏芦乙醇提取物能明显上调mTOR通路中mTOR、S6K1的基因表达，并能引起4EBP1基因的表达量显著降低。由此推断，漏芦乙醇提取物作用的奶山羊乳腺上皮细胞中mTOR信号通路对乳蛋白合成的调节不是通过4EBP1，而是通过促进乳腺细胞mTOR的表达，进而增强S6K1的磷酸化，提高其下游酪蛋白合成相关基因的翻译表达；漏芦乙醇提取物作用于奶山羊乳腺上皮细胞后，与酪蛋白合成有关的JAK2-STAT5及mTOR信号途径可能存在一定的协同效应，更有利于乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。

综上，漏芦乙醇提取物的添加剂量为25、50、100 μg/mL时，各处理组细胞活力和增殖能力无明显变化，而较高剂量(200～800 μg/mL)的漏芦乙醇提取物明显抑制乳腺上皮细胞的活力和增殖能力；漏芦乙醇提取物可能通过调节奶山羊乳腺上皮细胞JAK2-STAT5 和mTOR信号通路相关基因的表达，进而促进细胞内αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的合成。