山药提取物对虹鳟生长和非特异性免疫指标的影响

王 凡，李聪歌，马雅雯，刘 飞，孟祥杰

(洛阳师范学院 生命科学学院，河南 洛阳 471934)

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)因其独特的口味而深受广大消费者的青睐，是目前水产养殖最为广泛的冷水鱼之一，同时也是营养学研究领域的一种典型模式水生生物。随着大面积养殖的推广和集约化程度的不断提高，虹鳟的病害问题日趋严重[1]。预防和治疗疾病的最有效措施是使用抗生素，但传统抗生素的负面效应较大，容易导致药物残留，同时也会造成病原微生物的耐药性和对水环境的危害。已有研究表明，非特异性免疫在鱼病防治中扮演着重要角色[2]。因此，如何提高虹鳟的非特异性免疫功能、提高鱼类的抗病力已成为其健康养殖过程中的关键问题。

与抗生素相比，中草药具有增强机体非特异性免疫、促生长、无药物残留和来源广泛等独特优势，常被称为天然抗生素。在水产养殖过程中，很多专家也提出用中草药来替代抗生素的思路。已有研究表明，中草药能够促进鱼类的生长、增强鱼类的非特异性免疫功能、提高鱼类的抗病力[2-4]。山药是一种营养成分极高的中草药，山药中的微量元素及生物活性物质可以促进新陈代谢，合成蛋白质和各种酶，提高动物的生长性能，增强免疫力。已有研究表明，山药能够明显提高黄河鲤(Cyprinuscarpio)血清中C反应蛋白(CRP)及其补体3的含量、血液中硝基四氮唑蓝(NBT)阳性细胞数，降低血清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)含量[5]。但迄今为止，尚未发现有关山药对虹鳟免疫调控方面的研究。为此，研究山药提取物对虹鳟生长和非特异性免疫相关指标的影响，旨在探讨山药对虹鳟免疫调控的分子机制，以期为山药作为饲料添加剂在虹鳟养殖中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验饲料的制备 将20∶1山药提取物(每20 g山药原材料，提取出1 g的山药提取物；购自陕西森弗天然制品有限公司，薯蓣皂素含量16%)分别以0.1%、0.2%、0.4%的比例加入到虹鳟基础饲料的配方中，制成含有山药提取物的饲料，同时制备基础饲料，基础饲料中不含山药提取物，由此得到4种试验饲料。饲料原料经称取、粉碎，混匀后使用ZL-600颗粒机制作直径1.5 mm颗粒饲料，阴干24 h，放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 供试动物 虹鳟(Oncorhynchusmykiss)购自四川省眉山市东坡区天贵水产养殖场，体长7.6～8.9 cm，放在洛阳师范学院冷水鱼养殖工程研究中心冷水鱼循环系统中的饲养缸(直径×高=1 m×1 m)，用基础饲料暂养14 d。冷水鱼循环系统实时监测水温、pH值和溶解氧(DO)、氨氮(NH3-N)含量，每天定时、定点投饵3次，并记录投饵量及残饵量。暂养期间水温为11～15 ℃，pH值为7.0±0.2，DO>8 mg/L，NH3-N<0.007 5 mg/L。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 选取暂养后体态均匀、体质量为10.6～12.8 g且健康的虹鳟幼鱼进行试验。将供试虹鳟分为4组，对照组和3组山药提取物组，对照组投喂基础饲料，养殖周期为56 d，按照鱼体质量的3%～4%进行饲料投喂。各组设置3个重复，每个重复30尾，整体称质量后放入鱼缸中，试验期间水质条件和饲料管理条件同暂养期。

1.2.2 样品制备 投喂试验结束后，禁食24 h，每缸虹鳟整体称质量后，每组取6尾(每缸随机选取健康且大小均匀的2尾)，测量体长、称量质量。然后用酒精棉将鱼体消毒，再用已经消毒处理过的工具尾静脉取血，置于离心管中，在室温下放置1 h，再置于冰箱中4 ℃过夜，3 500 r/min离心15 min，制得血清，然后将其放置-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2.3 生长性能指标测定 根据虹鳟养殖后的终末体质量和养殖前的初始体质量，计算增重率(WGR)和特定生长率(SGR)。

WGR(%)=100×(终末体质量-

初始体质量)/初始体质量；

SGR(%/d)=100×(ln终末体质量-

ln初始体质量)/试验天数。

1.2.4 血清非特异性免疫指标测定 血清抗菌活力(Anti-bacterial activity,AA)的测定采用HULTMARK等[6]的改进方法。将活化后的大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基内，在摇床中35 ℃振荡培养48 h，然后用0.1 mol/L、pH值6.4的PBS缓冲液洗涤2次，将大肠杆菌配成A570为0.3～0.5的悬液，取300 μL该悬液于96孔酶标板孔内，冰浴，加入5 μL待测上述血清样品，混匀，在酶标仪中570 nm波长处测A0值;然后将酶标板移入37 ℃恒温培养箱中放置30 min，取出后再置冰浴中10 min，终止反应，再在酶标仪中570 nm波长处测其A值。

血清中溶菌酶(LZM)的活性测定采用比浊法，总蛋白(TP)含量测定采用BCA法，白蛋白(ALB)含量测定采用溴甲酚绿法，酸性磷酸酶(ACP)活性、碱性磷酸酶(ALP)活性和GPT活性测定采用微量酶板法，尿素氮(BUN)含量测定根据脲酶法，肌酐(CREA)含量测定采用肌氨酸氧化酶法。上述指标的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用WST-8法进行测定，其试剂盒购自碧云天生物技术公司。

血清中的补体4(C4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)的含量采用酶联免疫(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行检测。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0软件对试验数据进行单因素方差分析，并利用Dunnett’s法进行多重比较，试验数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 山药提取物对虹鳟生长性能的影响

由表1可知，山药提取物组虹鳟的WGR和SGR与对照组差异均不显著(P>0.05)。可见，山药提取物对虹鳟的生长无显著影响。

表1 山药提取物对虹鳟生长指标的影响

2.2 山药提取物对虹鳟血清抗菌能力和抗氧化酶活性的影响

与对照组相比，山药提取物组虹鳟的LZM和SOD活性有升高趋势(表2)，0.1%、0.2%、0.4%的山药提取物组LZM活性分别显著升高了42.41%(P<0.01)、34.95%(P<0.01)和27.89%(P<0.05)；0.2%和0.4%山药提取物组SOD活性分别显著升高了82.14%(P<0.01)和110.71%(P<0.01)。山药提取物组的AA和对照组相比无显著差异(P>0.05)。

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)，下同。

Note:* indicates significant difference compared to the control (P<0.05 ),** indicates highly significant difference compared to the control (P<0.01).The same below.

2.3 山药提取物对虹鳟血清生化指标的影响

与对照组相比，山药提取物组虹鳟的TP含量、ALB含量和ACP活性有升高趋势；BUN含量、CREA含量、GPT活性和ALP活性有降低趋势(表3)。0.4%山药提取物组ALB含量和ACP活性分别显著升高了30.73%(P<0.01)和63.77%(P<0.05)；0.2%和0.4%山药提取物组TP含量分别显著升高了36.49%(P<0.05)和45.97%(P<0.01)。0.1%、0.2%和0.4%山药提取物组BUN含量分别显著降低了51.20%(P<0.01)、64.06%(P<0.01)和49.80%(P<0.01)；0.2%和0.4%山药提取物组ALP活性分别显著降低了51.60%(P<0.01)和56.75%(P<0.01)；0.1%和0.2%山药提取物组GPT活性分别显著降低了77.37%(P<0.01)和60.71%(P<0.01)；0.1%山药提取物组CREA含量显著降低了41.96%(P<0.01)。

表3 山药提取物对虹鳟血清生化指标的影响

2.4 山药提取物对虹鳟血清补体和细胞因子的影响

山药提取物对虹鳟血清的补体4及细胞因子含量的影响见图1。与对照组相比，山药提取物组C4含量和细胞因子含量均呈升高趋势，其中C4含量显著性升高，0.1%、0.2%和0.4%山药提取物组分别升高了154.35%(P<0.05)、144.03%(P<0.05)和304.68%(P<0.01)；0.2%和0.4%山药提取物组的IL-6含量分别升高了45.01%(P<0.01)和56.25%(P<0.01)；0.2%和0.4%山药提取物组的TNF-α含量分别升高了247.32%(P<0.01)和414.15%(P<0.01)；0.2%山药提取物组IL-2含量显著升高了87.59%(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)

3 结论与讨论

中草药作为饲料添加剂在鱼类中的研究表明，其具有促生长的作用，尤其在复方中草药中表现比较明显[3-4]。但本研究发现，经过56 d的饲养试验，山药提取物组虹鳟的WGR和SGR与对照组比差异不显著，这与山药粉在黄河鲤的试验研究中结论一致[5]，表明单一的山药可能对硬骨鱼类的生长性能影响不大。

血清生化指标水平经常被用来评价动物的健康、营养和对环境的适应情况。BUN、CREA含量常是衡量肾功能的主要指标，它们在某种程度上反映了肾小球的滤过功能。本研究中，山药提取物能使虹鳟血清BUN含量极显著降低，且CREA含量也有降低的趋势，这表明山药提取物增强了虹鳟肾脏的机能。GPT活性是衡量肝功能的常用生化指标之一，肝细胞受到损伤时，它们通常会升高。本研究中，山药提取物组的GPT活性有降低的趋势，且在0.1%和0.2%山药提取物组极显著降低。这表明山药提取物没有对肝细胞造成损伤，反而对肝细胞具有一定的保护作用。血清中TP、ALB的含量是机体吸收、合成和分解蛋白质的标志性指标，也是机体免疫水平的间接反映[7]。ACP和ALP是动物溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥重要作用，ACP被认为是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，直接用于磷酸基团的转移，参与能量的转化和信号的转导，有助于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成，进而提高机体的非特异性免疫水平和营养代谢水平[8]。ALP是一种重要的代谢调控酶，在碱性介质中可通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物清除掉，同时参与钙、磷的代谢，在鱼类营养物质的吸收和利用方面发挥重要作用，其活性的高低与动物的生长性能关系密切[9]。本研究发现，山药提取物提高了虹鳟血清中TP、ALB含量和ACP活性，而降低了ALP活性，表明山药提取物通过提高血清TP、ALB的含量和ACP活性增强了虹鳟的免疫机能。崔晓翠等[10]研究发现，槟榔、川楝子复方中草药既能提高大黄鱼(Larimichthyscrocea)血清中ACP活性，也能提高ALP的活性；李思明等[11]研究发现，芦笋、薄荷叶等复方中草药也能够同时提高中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)血清中ACP、ALP与活性。这些研究结果中的中草药对ALP的影响与本研究结果不一致，可能是由于复方中草药通过ALP来调控水产动物免疫的机制和山药提取物不同所导致的。

LZM是动物体内一种非特异免疫因子，可以溶解细菌的细胞壁和调节其他免疫因子的合成与分泌，也能够促进动物体内有益菌的增殖，它的活性和抗菌活力直接关系到鱼类的免疫与健康[12]。SOD是机体内天然存在的一种清除超氧自由基的抗氧化酶，它的活性与生物的免疫水平密切相关。本研究中，山药提取物能使虹鳟血清的LZM活性显著升高，0.2%和0.4%山药提取物组的SOD活性也显著升高。这表明山药提取物促进了LZM和SOD的生物合成，从而提高了机体的LZM、SOD活性，增强了机体的抗病力与免疫力。

补体系统由多于35种可溶性血浆蛋白组成，其在先天性免疫中具有良好的作用，包括趋化、调理和消灭病原体[13-15]，补体的激活可以促进B细胞增殖、连接先天免疫系统与后天免疫系统[16-18]。C4是补体系统中重要的分子，也是补体经典激活途径的重要组分。本研究中，山药提取物组的C4含量显著升高，表明山药提取物可以提高C4的表达与分泌，促进补体经典激活途径，从而提高了虹鳟的免疫力和抗病力。陈成勋等[19]发现，黄芪多糖可以提高石斑鱼(Epinepheluscoioides)血清的C4含量，MUSTHAFA等[20]发现，添加一定剂量南瓜子喂养莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)，喂养28 d，补体活性显著增高。这些研究进一步说明了中草药可以通过促进补体的分泌与活化而对鱼类先天免疫反应有较明显的促进作用。

鱼类体内大部分细胞因子特别是促炎细胞因子(包括TNF-α、IL-2和IL-6等)都与细菌、病毒、炎症或细胞增殖以及趋化作用有关。TNF-α是巨噬细胞受到病原体等有害刺激产生的一种小分子蛋白。它能直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，是炎症反应必需的介质，也是一种多效性的免疫调节因子[21]。IL-2和IL-6分别是辅助性T细胞的2个亚群(TH1和TH2)分泌的细胞因子，在免疫调控中发挥重要作用[22]。本研究中，0.2%和0.4%的山药提取物可以显著提高虹鳟血清中的TNF-α、IL-6含量，且0.2%山药提取物组IL-2含量也显著性提高。这些结果表明了山药提取物促进促炎症因子表达与分泌，从而增强了虹鳟的免疫功能。

综上，在虹鳟基础饲料中添加山药提取物(20∶1)，对其生长性能无显著影响，但可以提高血清TP、ALB、C4、 TNF-α、IL-2、IL-6的含量，SOD、LZM、ACP活性，从而提高虹鳟的免疫功能。建议虹鳟饲料中山药提取物(20∶1)添加水平为0.2%～0.4%。