甲醇对α-淀粉酶活力及构象影响的研究

张建荣

摘要：目的：研究甲醇对α-淀粉酶活性及构象的影响。方法：拟合米氏方程求得Km.Vmax，并探讨甲醇对α-淀粉酶的活性影响。结果：以0.5%的淀粉为底物，加甲醇时km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，不加甲醇时km=0.0442m01/L，Vmax=88.495U/min.g，由此可知甲醇浓度在10%-50%范围内时，其对α-淀粉酶具有抑制作用。结论：本实验为进一步研究淀粉酶抑制剂提供理论基础。

关键词：淀粉;麦芽糖;α-淀粉酶;抑制剂

α-淀粉酶主要催化断开淀粉中α-，4糖苷鍵，并具有淀粉的液化和糖化作用，α-淀粉酶是影响饮食中淀粉等消化、吸收的关键酶，抑制其活性可以延缓人体对淀粉的降解和葡萄糖的吸收，从而抑制餐后血糖的快速升高。因此α-淀粉酶抑制剂常被用于治疗糖尿病。由于寻求α-淀粉酶抑制剂的成本高，人们更多地从廉价的化学药品中寻找高效的α-淀粉酶抑制剂，因此成为研究的热门话题。在研究α-淀粉酶的基础上，本研究主要探讨甲醇对α-淀粉酶的抑制效果。

一、材料与设备

（一）材料

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、淀粉、麦芽糖、α-淀粉酶、甲醇、DNS、蒸馏水。

（二）设备

电热恒温水浴锅（HH-S4型）：北京科伟永兴仪器有限公司;岛津分析天平（AUY220）、UV-250：日本岛津;722可见分光光度计;PHS-3D雷磁PH计：上海精科。

二、研究方法

（一）麦芽糖标准曲线的制作

取8支干净的试管，量取1mg/ml的麦芽糖，体积（m1）分别为0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0，在37℃下保温3min，再加入DNS试剂2ml，沸水浴5min，流水冷却，蒸馏水定容至25m1，在540nm处测OD值。

（二）α-淀粉酶活性的测定

1.取5支干净的试管，分别编号1-5。

2.准确量取0.5%的淀粉0.5ml于5个试管中，每个试管中加入对应的甲醇浓度为10%，20%，30%，40%，50%，样品管中分别加入10mg/ml的淀粉酶0.5m1，5只试管分别用蒸馏水补齐至2.0m1.

3.2.3、37℃下保温3min，然后加入DNS试剂2ml，沸水浴5min，流水冷却，蒸馏水定容至25ml，在540nm处测OD值。

（三）用1/s和1/v双倒数法作图计算Km和Vm

1.取8支干净的试管，分别编号1和1，2和2，3和3，4和4，1，2，3，4号管做为对照。

2.准确量取0.5%的淀粉溶液0.05ml于1和1试管中再加入甲醇0.8ml，1号管中加入lmg/ml的淀粉酶0.5ml，然后两试管用蒸馏水补齐至2ml;准确量取0.5%的淀粉溶液0.1ml于2和2试管中，再加入甲醇0.8ml，2号管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后两试管用蒸馏水补齐至2ml;准确量取0.5%的淀粉溶液0.2ml于3和3试管中，再加入甲醇0.8ml，3号管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后两试管用蒸馏水补齐至2ml;准确量取0.5%的淀粉溶液0.4ml于4和4号试管中，再加入甲醇0.8ml，4号管中加入1mg/ml的淀粉酶0.5ml，然后两试管均用蒸馏水补齐至2ml。

3.37℃下保温3min，再加入DNS试剂2ml，沸水浴5min，流水冷却，蒸馏水定容至25ml，在540nm处测OD值，根据方程1/V=（1/[S]）Km]Vmax+1/Vgmax，以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求得Km及Vmax值。

（四）用1/s和1/v双倒数法作图计算Km和Vm

不加甲醇，其它操作同上3.3。

（五）不同浓度甲醇处理后α-淀粉酶紫外吸收光谱

1.取7支干净的试管，分别编号0，0，1，2，3，4，5。

2.准确量取0.5 mllOmg/ml的淀粉酶于每支试管中，依编号向每支试管中分别加入甲醇0，5%，10%，20%，30%，40%，再用PH6.8的磷酸缓冲液补齐至3ml，室温静致20分钟。

3.测α-粉酶的紫外吸收光谱。

三、结果

（一）麦芽糖标准曲线的制作

如图-1所示麦芽糖的标准曲线的相关系数R2=0.9983，能够符合本实验的基本要求。

（二）在不同抑制剂浓度下α-淀粉酶活性的测定

由图-2可知，在酶反应体系中加入浓度分别为10%，20%，30%，40%，50%甲醇，结果发现甲醇对α-粉酶具有抑制作用，且甲醇浓度大于10%时抑制效果越明显。

（三）用1/s和1/v双倒数法作图计算Km和Vm

将米氏方程V=Vmax·[S]，（Km+[S]）转化为I/V=（Knl/Vmax）·（1/[S]）+1/Vmax形式，作出1/VO对1/[S]的双倒数图，可根据图形求出km和vm，进而推出相应的米氏方程。对实验结果进行处理做出1/VO～I/[S]图，如图-3所示。不加甲醇时得Km=0.0442mol/L，Vmax=88.495U/min.g，相应的动力学方程为V=88.495[$]/（0.0442+[S]），加甲醇时求得Km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，相应的动力学方程为V=88.496[S]/（0.265+[S]）。由图-3知Vmax几乎不变而Km增大，说明加入甲醇后α-淀粉酶对底物的亲和力减小，甲醇对于α-淀粉酶来说是一种竞争性抑制剂。

（四）不同浓度甲醇处理后α-淀粉酶紫外吸收光谱

在室温条件下，测定甲醇浓度分别为0，5%，10%，20%，30%，40%时，α-淀粉酶紫外吸收光谱。

由图-5可知，淀粉酶在280nm处有紫外吸收峰，这主要是由Trp和Tyr引起，随着甲醇浓度的增加，淀粉酶紫外吸收值开始下降。

四、结语

本实验在研究α-淀粉酶活性时，只做了甲醇浓度大于10%的部分，在该范围内抑制效果明显，在0-10%范围内既有抑制作用又有促进作用，经讨论该范围内甲醇的抑制实验不做。本实验操作简单易行，为进一步研究淀粉酶抑制剂提供理论基础，以0.5%淀粉为底物，加甲醇时km=0.265mol/L，Vmax=88.496U/min.g，不加甲醇时km=0.0442mol/L，Vmax=88.495U/min.g，由此可知甲醇对α-淀粉酶是竞争性抑制剂。