miR-370靶向FoxO1抑制TNF-α 诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

钱丽丽 闫秀明 张慧 张改 (河南医学高等专科学校检验系微免教研室，河南 郑州 451191)

肝癌为全球病死率最高的恶性肿瘤，中国每年约有38.3万人死于该病，其死亡数占世界肝癌死亡量的1/2，致死率仅次于肺癌居第二位〔1,2〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α涉及细胞凋亡和细胞增殖，不仅作为促炎细胞因子参与广泛的人类疾病，包括炎症性疾病，也可导致肿瘤的发展〔3,4〕。miRNA为19～25 个核苷酸组成的短链内源性非编码RNA，在肿瘤的发生发展中具有重要的调控作用〔5〕。大量研究报道，miR-370在肝癌中发挥抑制癌症恶化的作用〔6〕，但其作用机制尚未完全清楚。叉头框基因(Fox)广泛存在于各种真核生物细胞中，其中FoxO1为Fox基因家族中的一员〔7,8〕。研究报道，促进FoxO1在肝癌中的转录可抑制肝癌的恶化〔9〕。本研究观察TNF-α处理后HepG-2细胞的增殖、迁移和侵袭情况，并观察过表达FoxO1、抑制miR-370、敲减FoxO1对HepG-2细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞HepG-2购自美国模式菌种收集中心；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；基质胶、Transwell小室购自美国Corning公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2细胞培养 将肝癌细胞HepG-2培养于含10%FBS的DMEM高糖培养基(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度达到75%左右，用胰蛋白酶消化，每2 d传代1次。

1.3细胞处理与分组 用TNF-α (20 ng/ml)处理肝癌细胞HepG-2 48 h，标记为TNF-α组；pcDNA、pcDNA-FoxO1、anti-miR-con、anti-miR-370、anti-miR-370+si-con、anti-miR-370+si-FoxO1，按照LipofectamineTM2000转染说明书操作步骤转染至HepG-2细胞，转染后用20 ng/ml的TNF-α培养48 h，分别标记为TNF-α+pcDNA组、TNF-α+pcDNA-FoxO1组、TNF-α+anti-miR-con组、TNF-α+anti-miR-370组、TNF-α+anti-miR-370+si-con组、TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1组，实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测转染效率。确认转染成功后，用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验 取适量对数生长期转染和(或)TNF-α处理的各组HepG-2细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取细胞RNA，检测含量，然后以RNA为模板按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，检测浓度。最后根据qRT-PCR试剂盒说明书进行FoxO1 mRNA和miR-370的检测。用2-△△Ct法计算miR-370、FoxO1的表达水平。

1.5Western印迹实验 收集转染和(或)TNF-α 处理的各组HepG-2细胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，收集蛋白上清。取适量蛋白上清至EP管，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE后将蛋白条带用转膜仪转移至PVDF膜；置于5 %脱脂奶粉封闭2 h，洗膜3次，加入稀释的Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，洗膜3次，加稀释的酶标Ⅱ抗，4 ℃ 孵育2 h。加发光液，曝光。

1.6MTT实验 取对数生长期转染和(或)TNF-α 处理的各组HepG-2细胞，以2×103个细胞/孔接种于96微孔板中，在培养至24 h、48 h、72 h时进行 MTT 实验，每孔加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡，溶解结晶，酶标仪在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。

1.7Transwell小室检测细胞迁移侵袭 迁移实验：将转染和(或)TNF-α 处理的各组HepG-2细胞以106个/孔接种于6孔板，常规培养细胞融合度至80%，更换为无血清培养基过夜饥饿培养。培养液稀释各组细胞密度至105个/ml，Transwell上室加入100 μl细胞，下室加入600 μl含FBS的DMEM培养基，细胞常规培养12～18 h。取出上层小室，用棉签擦去上室内未迁移的细胞，PBS洗涤2次，甲醇固定迁移细胞30 min，0.1%结晶紫染色20 min。显微镜观察迁移细胞，随机选取3个视野拍照，计数，取平均数。侵袭实验：将Transwell上层小室内铺适量厚度的基质胶，后续步骤同迁移实验，显微镜观察并计数小室下表面附着的侵袭细胞。

1.8双荧光素酶报告基因检测实验 采用在线靶基因预测库target scan(http://www.targetscan.org/)检测到miR-370与FoxO1 3′非编码区(UTR)存在结合位点，为了验证这一预测，构建FoxO1 3′UTR-WT(含FoxO13′UTR片段)和FoxO1 3′UTR-MUT(含FoxO1 3′UTR片段突变体)的荧光素酶报告载体，根据1.3方法分别将FoxO1 3′UTR-WT和FoxO1 3′UTR-MUT与miR-370 mimics和miR-con共转染细胞，标记为miR-370组、miR-con组，培养24 h，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶激发值，以两者的比值评价FoxO1基因突变型和野生型的荧光素酶相对活性。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1TNF-α促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭 与Con组相比，TNF-α组肝癌HepG-2细胞在48 h和72 h细胞OD值显著升高，迁移和侵袭细胞数均显著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。见表1。

组别OD490 nm24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)Con组0.36±0.040.52±0.060.79±0.0884.74±8.5664.37±7.13TNF-α组0.42±0.030.71±0.051.24±0.06188.32±15.43140.38±9.74t/P值2.079/0.1064.214/0.0147.794/0.00210.167/0.00110.907/0.000

2.2TNF-α抑制FoxO1表达 与Con组相比，TNF-α组HepG-2细胞FoxO1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。见图1、表2。

图1 Con组和TNF-α组肝癌细胞FoxO1蛋白的表达

表2 TNF-α对肝癌细胞FoxO1表达的影响

组别FoxO1 mRNAFoxO1蛋白Con组1.12±0.110.55±0.05TNF-α组0.45±0.310.26±0.03t/P值3.528/0.0248.614/0.001

2.3过表达FoxO1可抑制TNF-α对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用 与TNF-α+pcDNA组相比，TNF-α+pcDNA-FoxO1组HepG-2细胞中FoxO1蛋白表达显著上升(P<0.001)。在处理后48 h和72 h细胞OD值显著降低(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著下降(P<0.01)。见表3和图2。

组别FoxO1蛋白细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)TNF-α+pcDNA组0.33±0.040.40±0.040.75±0.061.15±0.12175.63±17.94131.78±12.72TNF-α+pcDNA-FoxO1组0.86±0.030.37±0.030.58±0.050.84±0.0887.27±8.8369.59±7.47t/P值18.360/0.0001.039/0.3573.77/0.0203.723/0.0207.654/0.0027.302/0.002

2.4miR-370靶向FoxO1 运用target scan库预测miR-370与FoxO1的结合发现，miR-370与FoxO1 3′UTR序列中存在结合位点(图3A)；双荧光素酶报告系统检测结果显示，与miR-con组相比，miR-370组的FoxO1野生型WT-FoxO1细胞中荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而突变型MUT-FoxO1细胞中荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)，见表4。与miR-con组(0.56±0.05)相比，过表达miR-370组细胞中FoxO1蛋白表达(0.27±0.03)显著降低(P<0.05)，与anti-miR-con组(0.58±0.06)相比，anti-miR-370组细胞中FoxO1蛋白表达(0.92±0.08)显著升高(P<0.05)。图3B。

2.5抑制miR-370可抑制TNF-α对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用 与TNF-α+anti-miR-con组相比，TNF-α+anti-miR-370组HepG-2细胞中miR-370表达显著降低(P<0.001)，在处理后48、72 h细胞增殖显著降低(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.01)。见表5。

图3 miR-370靶向FoxO1

表4 双荧光素酶报告实验

组别WT-FoxO1MUT-FoxO1miR-con组1.03±0.111.07±0.11miR-370组0.42±0.061.11±0.13t/P值8.432/0.0010.407/0.705

组别miR-370细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)TNF-α+anti-miR-con组0.93±0.090.41±0.040.76±0.061.19±0.11174.74±15.56134.32±11.13TNF-α+anti-miR-370组0.23±0.020.39±0.030.55±0.050.89±0.09101.32±6.4380.75±5.81t/P值13.151/0.0000.693/0.5274.657/0.0103.656/0.0227.553/0.0027.390/0.002

2.6抑制miR-370和沉默FoxO1对TNF-α促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与TNF-α+anti-miR-con组相比，TNF-α+anti-miR-370组HepG-2细胞在处理后48和72 h细胞OD值显著降低(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)；与TNF-α+anti-miR-370+si-con组相比，TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1组HepG-2细胞在处理后48和72 h细胞OD值显著升高(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著升高(P<0.05)。见表6。

组别细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)TNF-α+anti-miR-con组0.42±0.040.87±0.061.18±0.12185.37±17.49135.78±11.71TNF-α+anti-miR-370组0.36±0.030.56±0.051)0.78±0.081)81.27±8.531)62.59±7.641)TNF-α+anti-miR-370+si-con组0.39±0.030.59±0.050.79±0.0884.27±8.3865.55±7.37TNF-α+anti-miR-370+ si-FoxO1组0.40±0.040.83±0.062)1.02±0.122)145.72±11.082)113.44±12.582)F/P值1.500/0.28725.205/0.00010.776/0.00453.395/0.00038.415/0.000

与TNF-α+anti-miR-con组比较:1)P<0.05；与TNF-α+anti-miR-370+si-con组比较:2)P<0.05

3 讨 论

TNF-α由巨噬细胞、自然杀伤细胞及中性粒细胞等分泌的促炎因子，在人类多种疾病中发挥作用，包括肿瘤〔10〕。有研究报道，TNF-α在肿瘤中具有双向的作用，其抗肿瘤作用或促肿瘤作用与TNF-α的浓度有很大关系，高浓度TNF-α可通过分泌特异性T细胞、破坏肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用，低浓度TNF-α可激活核细胞因子(NF)-κB信号通路发挥促肿瘤作用〔11,12〕。Hu等〔13〕报道，聚碳酸酯磁性微球对TNF-α具有强磁响应性和高TNF-α负载浓度，且对异种植瘤的裸鼠体内具有高抑制和抗肿瘤作用。雷一鸣等〔14〕在肝癌的研究中发现，TNF-α在肝癌组织中表达升高，且可通过上调苄氟素(BECN)1、微管相关蛋白(LC3B)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，促进癌细胞增殖。

miRNA在肿瘤中发挥肿瘤基因或肿瘤抑制基因的作用，这在国内外均得到普遍认可〔15〕。miR-370在肿瘤中的调节较复杂，兰敏〔16〕报道，miR-370在多种肿瘤的发生、发展、转移及耐药中均具有调节作用，如在肝癌、口腔癌、膀胱癌中下调发挥抑癌作用，在甲状腺癌、子宫内膜癌中上调发挥致癌作用，而在胃癌、肺癌中既具有上调作用也具有下调作用〔17〕。孙戈等〔18〕报道，miR-370在肝癌中表达显著下调，且与肝癌的恶性指标及生存率密切相关。Pan等〔19〕在肝癌的研究中发现，miR-370在肝癌组织中的表达显著降低，且与肿瘤的淋巴转移、分期及总体生存率显著相关，提示，miR-370的水平可作为临床评估的独立预后标志物。本研究发现，抑制miR-370可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，推测其可能与调控TNF-α的表达有关。

FoxO1基因在机体各种组织器官中广泛表达，参与细胞凋亡、DNA损伤修复、免疫调节及氧化应激等生物学过程〔20,21〕。FoxO1在多种肿瘤中表现为下调，发挥抑癌作用，其中包括肝癌〔22,23〕。张国强等〔24〕在肝癌的研究中发现，LINC00598、FoxO1在肝癌中表达均异常降低，且可上调肝癌的风险系数，提示LINC00598可抑制肝癌的恶化，其可能与顺势调控FoxO1的表达有关。Jiang等〔25〕在肝癌的研究中发现，三氟拉嗪(TFP)可抑制肝癌细胞的活力，诱导细胞周期停滞于G0/G1期和细胞凋亡，下调细胞迁移或侵袭的能力，且将FoxO1的细胞质定位逆转为核定位并增加其在核中的表达，敲低FoxO1可显著逆转TFP诱导的细胞凋亡，此外，TFP可增加FoxO1的核定位，提示上调FoxO1在肝癌中可发挥抗肿瘤作用。本研究发现，过表达FoxO1在肝癌的恶性进程中发挥抑制作用，敲减FoxO1可促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭。

综上，miR-370可靶向FoxO1调控TNF-α对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，miR-370可能是肝癌的新靶标。