芩黄凝胶剂精制工艺的优化

林 雄，严国鸿，潘旭东，黄 燕，钟树仁

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

芩黄凝胶剂是在福建中医药大学附属人民医院蛇伤救治中心特色制剂“三黄散”（批准文号闽药制字Z06106062）的基础上改进而成的水性外用凝胶剂，具有清热解毒、消炎镇痛的功效，临床上用于治疗毒蛇咬伤，相较于原药调配繁琐、使用不便、易导致患者疼痛难忍、出现过敏症状等弊端，它具有使用舒适方便、药物作用时间长、对皮肤无刺激作用等优点。该方由黄芩、大黄组成，两者共为君药，其中前者具有清热燥湿、凉血安胎、泻火解毒等功效，主要成分黄芩苷具有抗炎抗菌、抗过敏等作用［1］；后者具有泻下攻积、清热泻火、止血解毒、活血祛瘀等功效，主要成分大黄蒽醌具有解热镇痛、抗菌消炎等作用［2］。本实验在前期研究确定的最佳提取工艺基础上，采用正交试验结合多指标综合评分优化芩黄凝胶剂精制工艺，为该制剂最佳制备工艺的研究奠定基础。

1 材料

Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪（美国戴安公司）；CPA225D 电子天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；KQ-500DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZT-5 L 旋转蒸发仪（上海增森仪器科技有限公司）。

大黄素、大黄酸、大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 110756-201512、110757-201607、110796-201621）；芦荟大黄素、大黄素甲醚、黄芩苷对照品（美国CATO 标准品，批号分别为CE-11-16、CE-11-17、CE-11-15）。大黄（安徽协和成药业饮品有限公司，产地甘肃，批号17113015）、黄芩（亳州市泸谯药业有限公司，产地山西，批号1709100132）经福建中医药大学附属人民医院鄢英慧副主任中药师鉴定为正品，符合2015 版《中国药典》 一部项下要求。壳聚糖（黏度200～400 mPa·s，上海麦克林生化科技有限公司）。甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯；水为经0.45 μm微孔滤膜过滤的纯化水。

2 方法与结果

依据前期实验结果，结合文献［3-10］确定药液醇沉和壳聚糖澄清正交试验设计方案，以黄芩中黄芩苷和大黄中蒽醌类成分（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）转移率为评价指标，采用多指标综合评分进行考察，确定黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的权重系数分别为0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1。

2.1 正交试验

2.1.1 提取液制备 称取处方量药材，加6 倍量水浸泡0.5 h后回流提取2 次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，即得，减压浓缩备用。

2.1.2 醇沉工艺设计 选用L9（34）正交表，以醇沉体积分数、药液质量浓度、静置时间、搅拌速度为影响因素，每个因素3 个水平，见表1。

2.1.3 澄清工艺设计 选用L9（34）正交表，以药液质量浓度、1%壳聚糖加入量、沉淀温度、静置时间为影响因素，每个因素3 个水平，见表2。

表1 醇沉工艺因素水平

表2 澄清工艺因素水平

2.2 黄芩苷含有量测定

2.2.1 色谱条件 Amethyst C18-H 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸（57∶43）；检测波长280 nm；柱温50 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.2.2 线性关系考察 精密称取黄芩苷对照品适量，置于100 mL 量瓶中，甲醇定容至1.064 mg/mL，精密吸取5 mL置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至212.80 μg/mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以黄芩苷质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y=0.629 1X-2.378（r=0.999 8），在10.64～212.80 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备 分别按醇沉、澄清工艺制得药液后各精密吸取1.0 mL，稀释至100 mL，再精密吸取1.0 mL，甲醇定容至10 mL，超声30 min，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺黄芩处方量药材，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 重复性试验 精密吸取同一精制药液1 mL，平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样各10 μL 测定，测得黄芩苷峰面积RSD为2.45%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密吸取含有量已知的精制药液0.5 mL，精密加入10.0 mL 贮备液，按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩苷平均加样回收率为101.2%，RSD 为1.97%。

2.2.7 专属性考察 精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，色谱图见图1，可知阴性无干扰，方法专属性良好。

2.3 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含有量测定

2.3.1 色谱条件 Amethyst C18-H 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；检测波长430 nm；柱温40 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

图1 黄芩苷HPLC 色谱图

2.3.2 线性关系考察 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置于50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，制得质量浓度分别为202.20、204.00、211.20、395.20、201.00 μg/mL 的贮备液，精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为芦荟大黄素Y=0.475 1X-0.046 7（r=0.999 9），线性范围2.022～101.1 μg/mL；大黄酸Y=0.470 2X-1.188 4（r=0.999 4），线性范 围2.040～102.0 μg/mL；大黄素Y=0.435 2X-0.014 1（r=0.999 9），线性范围2.112～105.6 μg/mL；大黄酚Y=0.491 1X+0.006 6（r=0.999 9），线性范围3.952～197.6 μg/mL；大黄素甲醚Y=0.411 9X+0.288 9（r=0.999 4），线性范围2.010～100.5 μg/mL。

2.3.3 供试品溶液制备 精密吸取精制药液1.0 mL，加入8%盐酸、三氯甲烷各10 mL，回流提取1 h，放冷，转移至分液漏斗中，少量三氯甲烷洗涤容器，洗涤液并入分液漏斗中，取三氯甲烷层，剩余药液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，挥干溶剂，残渣加适量甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，甲醇定容，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性对照溶液制备 称取缺大黄处方量药材，按“2.3.3”项下方法制备，即得。

2.3.5 重复性试验 精密吸取同一精制药液1.0 mL，平行6 份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD 分别为1.59%、1.14%、1.93%、1.65%、1.86%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密吸取含有量已知的精制药液1 mL，平行6 份，精密加入对照品溶液 ［芦荟大黄素（203.50 μg/mL）0.8 mL、大黄酸（217.15 μg/mL）1.1 mL、大黄素（204.2 μg/mL）0.9 mL、大黄酚（385.56 μg/mL）0.9 mL、大黄素甲醚（200.44 μg/mL）0.4 mL］，按“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚平均加样回收率分别为101.2%（RSD=1.95%）、100.6%（RSD=1.97%）、101.2%（RSD=2.11%）、99.9%（RSD=1.60%）、98.7%（RSD=2.37%）。

2.3.7 专属性考察 精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，每个样品平行2 次，色谱图见图2，可知阴性无干扰，方法专属性良好。

图2 大黄蒽醌HPLC 色谱图

2.4 试验结果 通过多指标综合加权评分法（权重系数同上）进行直观分析和方差分析，综合评分（X）［11］计算公式为X=0.5a+0.1b+0.1c+0.1d+0.1e+0.1f，其中a=黄芩苷转移率/最大值×100、b=芦荟大黄素转移率/最大值×100、c=大黄酸转移率/最大值×100、d=大黄素转移率/最大值×100、e=大黄酚转移率/最大值×100、f=大黄素甲醚转移率/最大值×100。结果见表3～6。

表3 醇沉工艺正交试验结果

表4 醇沉工艺方差分析

表5 澄清工艺正交试验结果

表6 澄清工艺方差分析

由此可知，醇沉工艺中各因素影响程度依次为A（醇沉体积分数）＞B（药液质量浓度）＞D（搅拌速度）＞C（静置时间），其中A、B、D有显著影响（P＜0.05），而C无显著影响（P＞0.05），最佳条件为A1B1C2D3，即醇沉体积分数50%，药液质量浓度0.8 g/mL，静置时间48 h，搅拌速度180 r/min。澄清工艺中各因素影响程度依次为A（药液质量浓度）＞B（1% 壳聚糖加入量）＞C（沉淀温度）＞D（静置时间），其中A有显著影响（P＜0.05），而B、C、D无显著影响（P＞0.05），最佳条件为A1B1C1D1，即药液质量浓度0.25 g/mL，1%壳聚糖加入量10%，沉淀温度40 ℃，静置时间24 h。

2.5 验证试验 分别按最佳醇沉、澄清工艺进行3 批验证试验，结果见表7～8，可知该方法稳定可靠。

表7 醇沉工艺验证试验结果（n ＝3）

表8 澄清工艺验证试验结果（n＝3）

3 讨论

在检测大黄蒽醌［12］过程中发现，检测波长254 nm 下采用等度梯度或梯度洗脱时，待测成分与干扰成分均无法实现良好分离，这是因为该类成分在254、430 nm 波长下均有最大吸收［13］。经研究显示，色谱条件为流动相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）、检测波长430 nm、柱温40 ℃时，待测成分分离效果最理想。

芩黄凝胶剂为多种成分组成的中药复方制剂，由黄芩、大黄组成，两者配伍相须相使，共为君药，故选择其主要有效成分作为待测指标，但若仅单独选择黄芩苷或大黄蒽醌作为检测指标，则无法全面评价工艺。因此，本实验采用正交试验结合多指标综合评分，既能更准确反应工艺优劣，又可有效减少工作量，综合考虑黄芩、大黄在制剂处方中的用量和作用，将黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚权重系数分别设定为0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1，更加合理可行。同时，本实验选择黄芩苷、大黄蒽醌转移率而非其含有量作为评价指标，能更客观地体现精制工艺在芩黄凝胶剂制备过程中所发挥的作用，有利于该制剂内在质量控制。