HPLC 法同时测定筋骨伤喷雾剂中7 种成分

2020-05-12李佳蔚徐家怡程吉祥

中成药 2020年2期

李佳蔚，王娇，徐家怡，程吉祥，刘青，伍庆∗

（1.贵州师范大学，贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳 550001；2.贵州远程制药有限责任公司，贵州贵阳 550018）

筋骨伤喷雾剂是以贵州苗药赤胫散为主，配以地龙、赤芍、淫羊藿、制草乌、薄荷脑，55%乙醇浸制而成，具有消肿止痛、活血化瘀的作用，用于摔伤、扭伤等软组织损伤，方中君药赤胫散为蓼科植物赤胫散Polygonum runcinatumBuch.-Ham.ex D.Don var.sinenseHemsl.的干燥根茎，分布于四川、贵州、云南等地，其性寒，味苦、涩，无毒，具有活血舒筋、清热解毒之功效，主治劳伤腰痛、跌打损伤等［1-4］，主要含有酚酸、挥发油［5-7］，其中鞣花酸是一种有效的凝血剂［8］，对多种细菌、病毒都有很好的抑制作用［9］，能保护创面免受细菌侵入，防止感染，抑制溃疡［10］；赤芍主要成分芍药苷具有广泛的抗炎作用［11-14］，并且表现出明显镇痛活性［15］；淫羊藿主要包括黄酮、生物碱、多糖等多种活性成分，其中淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 是黄酮类代表成分，具有促进骨骼发育的作用，可提高骨密度，增加骨强度［16］，上述7 种成分药效均与筋骨伤喷雾剂功能主治一致。

然而，现行筋骨伤喷雾剂质量标准对君药赤胫散仅有TLC 定性鉴别［17］，而定量指标仅为赤芍中芍药苷［3］，过于简单，难以有效控制产品质量。为了进一步发挥中药多组分的协同作用，保证产品质量均一、稳定、可控［18-20］。本实验建立HPLC 法同时测定筋骨伤喷雾剂中芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的含有量，以期为该制剂质量标准建立提供理论依据和数据支撑。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪（配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD 检测器）、Agilent 色谱工作站（美国Agilent 公司）；CH-250超声波清洗机（北京创新德超声电子研究所）；HH-4 数显恒温水浴锅（邦西仪器科技有限公司）；XS-105 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；移液枪（20～200、100～1 000 μL，德国Eppendorf公司）。

1.2 试剂与药物芍药苷（批号wkq18032104）、鞣花酸（批号wkq18020502）、朝藿定A（批号wkq17040509）、朝藿定B（批号wkq17032809）、朝藿定C（批号wkq17040701）、宝藿苷Ⅰ（批号wkq16081303）对照品均购于四川维克奇生物科技有限公司；淫羊藿苷（批号110737-200414）对照品购于中国食品药品检定研究院。筋骨伤喷雾剂（100 mL/瓶，贵州远程制药有限责任公司，批号20181003）。乙腈、甲醇为色谱纯；甲醇、正丁醇、磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05 mol/L 磷酸二氢钾（B）-甲醇（C），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；检测波长0～23 min 时230 nm，23～54 min 时254 nm，54～137 min 时270 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，甲醇溶解制得质量浓度分别为4.000、2.400、1.500、1.200、0.900、1.180、0.900 mg/mL，精密量取适量，甲醇稀释，即得（质量浓度分别为0.529、0.322、0.034、0.022、0.050、0.056、0.029 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液精密吸取本品5 mL，置于蒸发皿中蒸干，精密加入5 mL 水溶解，溶解液转移至分液漏斗中，10 mL 水饱和正丁醇溶液萃取2次，取上层澄清液置于蒸发皿中蒸干，甲醇溶解后定容至10 mL 量瓶中，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按照本品处方及生产工艺，分别制备缺赤胫散、赤芍、淫羊藿的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000。

2.3.2 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下鞣花酸对照品溶液0.134、0.335、0.671、1.010、1.340、1.675 mL，置于5 个5 mL 量瓶中，分别加入芍药苷对照品溶液0.132、0.331、0.661、0.992、1.322、1.653 mL，朝藿定A 对照品溶液275、220、165、110、55、22 μL，朝藿定B 对照品溶液225、180、135、90、45、18 μL，朝藿定C对照品溶液700、560、420、280、140、56 μL，淫羊藿苷对照品溶液600、480、360、240、120、48 μL，宝藿苷Ⅰ对照品溶液400、320、240、160、80、32 μL，甲醇定容，摇匀，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积RSD 分别为2.1%、2.9%、0.8%、1.6%、0.7%、0.6%、0.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取同一批本品（批号20181003），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ含有量RSD 分别为1.4%、2.3%、2.8%、2.4%、2.4%、2.3%、2.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取“2.3.4”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积RSD 分别为2.2%、2.7%、2.5%、1.8%、2.2%、1.6%、0.9%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密量取含有量已知的本品（批号20181003）9 份，每份2.5 mL，置于100 mL 蒸发皿中，精密加入适量芍药苷（0.500 mg/mL）、鞣花酸（0.448 mg/mL）、朝藿定A（0.024 mg/mL）、朝藿定B（0.037 mg/mL）、朝藿定 C（0.023 mg/mL ）、淫羊藿苷（0.152 mg/mL）、宝藿苷Ⅰ（0.011 mg/mL）对照品溶液，使高、中、低质量浓度对照品加入量与供试品中待测定成分量之比分别在0.5∶1、1∶1、1.5∶1 左右，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每种质量浓度3 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。测得芍药苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ平均加样回收率分别为95.6%、96.0%、97.8%、94.5%、93.5%、96.7%、99.6%，RSD 分别为1.4%、1.8%、2.3%、1.5%、2.7%、2.4%、1.9%。

2.4 样品含有量测定取3 批本品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批3 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg/mL，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/mL，n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择本实验考察了水饱和正丁醇、乙酸乙酯对各成分提取率的影响，发现后者萃取后不能检测出朝藿定A，故选择前者作为萃取剂。然后，又对萃取时pH 值（酸性、中性、碱性）、萃取次数（1、2、3 次）进行了考察，最终确定供试品溶液制备方法为中性纯净水加入10 mL 水饱和正丁醇萃取2 次。

3.2 色谱条件优化本实验考察了流动相甲醇-水、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾，确定乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇，此时各色谱峰分离效果最佳。再考察了检测波长，发现芍药苷、鞣花酸、淫羊藿苷最大吸收波长分别为230、254、270 nm，并且0～23 min 时230 nm、23～54 min 时254 nm、54～137 min 时270 nm 下各成分响应值较高，峰形良好，分离度理想。