东北苦菜UPLC 指纹图谱建立及化学模式识别

姚广哲，马文娟，贾 琪，欧阳慧子，常艳旭，何 俊∗

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

东北苦菜为菊科苦苣菜属植物变色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。在2015 年第20 号公告中，吉林省食品药品监督管理局将1977 年版《吉林省药品标准》 中的北败酱修订为东北苦菜［1］。东北苦菜味苦、性寒，具有清热解毒、清痈、化瘀排脓等功效，临床上常用于肠炎、急性咽炎、产后瘀血腹痛、急性细菌性痢疾等疾病的治疗［2-4］。据相关报道［5-6］，东北苦菜中主要含有黄酮类、多糖类、挥发油和有机酸类等成分，但仅测定单一成分（绿原酸）的含有量，并不能有效的对其进行质量控制。因此，需要建立高效、快速的分析检测方法，以便能够更加全面的评价东北苦菜药材的质量。

中药指纹图谱是能够标示化学成分特征的色谱图，其中潜藏着大量数据和变量，对其进行挖掘和评价，可以有效的反映出中药内在的化学成分信息。但目前对中药成分的处理仅使用相似度评价系统，存在一定的弊端，不能多层次、全方面地对药材进行整体分析，很难准确地评价药材的内在真实质量［7-8］。化学模式识别方法能对中药指纹图谱信息进行深入分析，快速筛选出需要重点关注的标志性成分，能有效的弥补指纹图谱评价方法中的不足，将二者有机结合，对中药的质量在整体性的基础上得以有效的控制，更快速的识别出中药复杂成分信息，达到区分药物质量差异的目的［9-10］。因此，本实验采用UPLC 法建立东北苦菜指纹图谱，并结合化学模式识别方法对所得指纹图谱进行综合分析，判断结果能直观地反映不同产地样品之间的质量差异，以期为东北苦菜药材的质量评价研究提供参考。

1 材料

Agilent1290 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（天津信睿生物科技有限公司）；AS 60/220.R2 型天平（十万分之一，苏州培科实验室仪器科技有限公司）；G3KT18273型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）；5424R 型高速控温离心机（德国Eppendorf 公司）。对照品绿原酸（批号MUST-18030620）、异槲皮苷（批号MUST-17051005）、木犀草苷（批号 MUST-17121210）、木犀草素（批号MUST-17102605）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡酸（批号110885-200102）购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇（色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司）；超纯水由Milli-Q 制备。

东北苦菜采自吉林省不同地区，经天津中医药大学何俊研究员鉴定为菊科苦苣菜属植物变色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。药材经粉碎后，过3 号筛，保存于天津中医药大学中医药研究院。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 CORTECS C18柱（2.1 mm ×150 mm，1.6 μm）；流动相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，90%～81.5% A；8～20 min，81.5%～81.3% A；20～25 min，81.3%～81.3% A；25～35 min，81.3%～60% A；35～40 min，60%～40%A；40～50 min，40%～25%A）；体积流量0.1 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL；检测波长 1～15 min，327 nm；15～50 min，360 nm。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称定对照品（绿原酸、木犀草素、异槲皮苷、木犀草苷、咖啡酸）各5 mg，加甲醇溶解并定容于5 mL 量瓶中，配制成质量浓度为1 mg/mL 的贮备液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.3 供试品溶液制备 精密称取东北苦菜粉末0.1 g，加甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，超声提取（300 W，50 kHz）30 min，静置室温后，加甲醇补足至刻度线，摇匀，14 000 r/min 高速离心10 min，吸取上清液，微孔滤膜过滤，取续滤液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密称取样品S4 6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，测得各共有色谱峰相对保留时间及峰面积RSD 达到规定要求，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 精密称取样品S4 6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，测得各共有色谱峰相对保留时间及峰面积RSD 达到规定要求，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 对样品S4 供试品溶液进行精密吸取，在“2.1”项条件下，分别于0、2、4、6、12、24 h 进样，测得各共有色谱峰相对保留时间及峰面积RSD 达到规定要求，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 结果与分析

2.5.1 指纹图谱建立及相似度分析 使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对所得的不同批次药材的指纹图谱数据进行分析，以S4 为参照色谱图，采用多点校正法建立指纹图谱［11］，得到10 个东北苦菜指纹图谱见图1，从该软件分析得出，10 批东北苦菜样品相对标准指纹图谱（R）的相似度均在0.953 以上。结果表明，各产地的东北苦菜指纹图谱具有较高的一致性。相似度分析结果见表2。

2.5.2 色谱峰指认 本研究根据相对保留时间标定特征指纹峰，通过对照品对各共有色谱峰进行指认，最终共确认了5 个色谱峰，分别为2 号峰（绿原酸）、3 号峰（咖啡酸）、11 号峰（异槲皮苷）、12 号峰（木犀草苷）、19 号峰（木犀草素），结果见图2。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 10 批样品相似度Tab.2 Similarities of ten batches of samples

图2 各成分UPLC 色谱图Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.6 化学模式识别方法

2.6.1 聚类分析 本研究应用SPSS 24.0 软件，以共有峰的相对峰面积为变量，对东北苦菜样品的数据进行聚类分析，方法为组间平均连接法，度量标准为欧氏距离［12］，结果见图3。当距离刻度为25 时，10 批样品主要分为2 大类，S9 为第1 类，S10、S3、S4、S7、S1、S8、S5、S6、S2 为 第2 类。

图3 10 批样品聚类树状图Fig.3 Dendrogram of ten batches of samples

2.6.2 主成分分析 本研究中的变量为指纹图谱中所得到的共有峰的峰面积，以此构建10×19 的原始数据矩阵，并使用变量统计分析软件（SIMCA14.1）对10 批东北苦菜样品进行主成分分析，Par 作为标度化方式，绘制出主成分分析图，见图4。结果表明，不同批次的东北苦菜样品呈现出明显的分类，证实了聚类分析的结果。图5表明，载荷图中的每一个点表示为一个色谱峰，其与原点（0，0）距离的远近，代表该色谱峰对样品整体分布贡献程度的大小［13-14］。2 号、12 号和13 号色谱峰在坐标系中距离原点较远，表明其对东北苦菜药物的整体质量起到了重要影响作用。

图4 10 批样品主成分分析图Fig.4 Principal component analysis plot for ten batches of samples

图5 10 批样品主成分分析载荷图Fig.5 Load scatter diagram of ten batches of samples

2.6.3 正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）本研究采用有监督的OPLS-DA 模型进一步对样品的数据进行分析，得到各批次样品间的差异性成分，见图6。由模型分析验证参数可知，结实率参数R2X 为0.871，区分参数R2Y 为0.984，预测参数Q2 为0.748，以上数据均大于0.5，表明模型稳定并且具有较好的预测准确性［15］。为进一步筛选出对上述样品分类贡献较大的成分，本研究以变量投影重要度（Variable Importance for the Projection，VIP）＞1.0 为筛选标准［16］，对数据进行处理分析。共得到3 个有意义变量，按照变量投影重要度值大小依次为2 号峰（绿原酸）＞12 号峰（木犀草苷）＞13 号峰，见图7。这些成分是10 批样品之间产生差异的主要原因，具有一定的标志性作用，该结果与主成分分析中载荷图的分析结果一致。为了更加全面、高效地评价药物质量，在以后对东北苦菜的研究中应重点关注上述成分的质量变化。

图6 10 批样品OPLS-DA 分析散点图Fig.6 Scatter diagram of OPLS-DA of ten batches of samples

3 讨论

实验通过对东北苦菜药材进行全波长DAD 检测器扫描，比较不同波长下的图谱信息发现，绿原酸在360 nm 处的吸收值远远低于327 nm 处，其他成分在360 nm 均有较好的吸收值，为了不影响各成分的紫外检测，且满足各成分在最大吸收波长范围内均有稳定的紫外吸收，因此，选用327、360 nm为检测波长［17-18］。建立了东北苦菜的UPLC指纹图谱，并对10 批样品进行了相似度评价，结果显示10 批样品相似度均在0.953 以上；图谱中有19 个共有峰，标定了5 个化合物，经指认为绿原酸、咖啡酸、异槲皮素、木犀草苷、木犀草素。

图7 10 批样品各成分VIP 图Fig.7 VIP diagram of various constituents from ten batches of samples

为了改进相似度评价系统对指纹图谱数据处理的不足，采用化学模式识别技术对指纹图谱的数据进行分析，可以更加客观的评价中药真伪与优劣［19-20］。本实验采用指纹图谱相似度评价和化学模式识别技术相结合的方法对不同产地的东北苦菜进行研究，3 种分析结果相互验证，系统地阐明东北苦菜药材内在质量特征，以期为今后其质量控制提供参考。