白及多糖响应曲面法优化提取工艺及抑菌活性研究

何晓梅，申 男，朱富成，乔德亮，张珍林，杨 静

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

白及Bletilla striataRchb.f.为兰科白及属的多年生草本植物[1]，也称“白芨”，以干燥块茎入药。我国白及主要分布在秦岭、淮河以南大部分地区[2]。白及主治功效包括补肺，止血，消肿，生肌，敛疮[3]。

现代药理研究表明白及块茎中含有40%～50%天然水溶性的白及多糖，是白及的主要功效成分。白及多糖具有收敛、延缓皮肤衰老、增稠、助悬、保湿和助乳化等功效，是一种理想的天然日化添加剂和功能性成分；在药理方面，白及多糖具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力[4]等特点。本文以白及干燥块茎为实验材料，通过单因素和响应曲面实验确定白及多糖提取最佳条件，采用滤纸片-抑菌圈法研究其抑菌活性。

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

菌种：金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，黑曲霉(Aspergillu nigers)由皖西学院微生物实验室提供。

白及粉，采用两年生干燥白及块茎置于粉碎机粉碎，过120目筛。无水乙醇、蒽酮、硫酸、胰蛋白胨、琼脂等，以上试剂均为国产分析纯。

1.2 设备

高速组织捣碎机(上海净信实验设备科技部)、ZMD-2型电子分析天平、HH-4C型数显恒温水浴锅、RE-52AA型旋转蒸发器、TU1901型紫外分光光度计、SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵、LDZX-50KBS型高压蒸汽灭菌锅、DHG-9101-1型电热恒温鼓风干燥箱、SW-CJ-IBU型超净工作台。

2 实验方法

2.1 单因素实验

精密称取2.0000 g白及粉末，按照一定的提取时间、提取温度、液料比进行单因素实验，水浴浸提，取出，离心(4000rpm，15 min)，收集上清液，用0.2%蒽酮-硫酸法测定多糖含量[5]。根据文献[6]醇沉、离心、干燥制备白及粗多糖。

2.2 响应曲面确定最佳提取条件

采用Box-Behnken试验方法对A提取时间(h)、B提取温度(℃)、C液料比(mL/g)进行三因素三水平试验设计[7]，试验条件见表1。

表1 3因素3水平实验

实验数据采用Design Expert 8.0.6软件分析。

2.3 白及多糖抑菌活性测定

参照文献[8-10]，菌种活化成功后，接种环刮取菌落于无菌水中梯度稀释成菌悬液OD600nm≈0.8，吸取0.5mL菌悬液，涂布平板。用镊子取出在白及多糖溶液(40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL)和无菌水中浸没2h的滤纸圆片(直径9 mm)，均匀平贴于培养基，每组设3个平行培养基。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌置于37±1℃恒温箱中培养24h，黑曲霉菌于28±1℃恒温箱中培养48h。结果采用十字交叉法测定滤纸片的抑菌圈直径大小，多次测量取平均值。

2.4 数据处理方法

3 实验数据处理分析

3.1 单因素实验结果

图1 浸提次数对多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction times on polysaccharideyield(浸提条件：水提时间2 h 、水提温度70℃、液料比40∶1)

图2 水提时间对多糖得率的影响Fig.2 Effect of waterextraction time on polysaccharide yield

图3 水提温度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of waterextraction temperature on polysaccharide yield

图4 液料比对多糖得率的影响Fig.4 Effect of liquid-solidratio on polysaccharide yield

由图1～4可知，实验采用一次浸提；在液料比为35：1 mL/g，水浴温度为70℃的条件下，多糖得率随着水浴时间的增加而增加；在水浴时间2h，液料比为35：1 mL/g的条件下，多糖得率在50℃～70℃的条件下缓慢升高，在80℃～90℃的条件下多糖得率下降；在水浴时间为2 h，水浴温度为70℃的条件下，多糖得率随着液料比的增加而增加，但是在35：1 mL/g～40：1 mL/g时，多糖得率有所下降。

3.2 响应曲面确定最佳提取条件

表2 多糖提取工艺响应试验设计

由表2可知，以A提取时间(h)、B提取温度(℃)、C液料比(mL/g)为自变量，Y(多糖得率)为响应值，得出Y对3因子的拟合回归方程为：

Y=26.86+3.83A-0.22B+1.77C+0.54AB+0.87AC+0.19BC-4.52A2+1.28B2+2C2

表3 回归方程模型系数评估及其显著性检验

分析水提温度(A)、水提时间(B)和液料比(C)3因子两两交互作用对水浴提取白及多糖得率的影响，P=0.0039<0.0500表示模型项显著，实验具有可靠性。

图5 Y=F(A，B)的响应曲面图与等值线图Fig.5 Response surface diagram and contour map of Y=F(A，B)

图6 Y=F(A，C)的响应曲面图与等值线图Fig.6 Response surface diagram and contour map of Y=F(A，C)

图7 Y=F(B，C )的响应曲面图与等值线图Fig.7 Response surface diagram and contour map of Y=F(B，C)

由统计性分析及响应面图可知，3因子对白及多糖得率的影响程度大小排序：水提温度(A)>液料比(C)>水提时间(B)。通过软件分析得出最佳提取条件：水提温度77℃、水提时间2.2h、液料比39.27 mL/g时，软件预测白及多糖得率为31.09%，在上述条件下进行三次重复试验，白及多糖得率为30.44%、31.81%、31.54%，平均31.26%，结果可信。

3.3 白及多糖的抑菌效果

表4 抑菌实验结果

表4表明，白及多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉菌均有不同程度的抑制作用，随着白及多糖浓度的增加这种抑制作用呈现逐渐增强的趋势。在实验浓度范围内，白及多糖对细菌的抑制作用强于真菌。

4 结论

单因素和响应曲面实验表明白及多糖提取的最佳条件为：水提次数1次、水提温度77℃、水提时间2.2 h、液料比39.27 mL/g，白及多糖得率31.09%。抑菌实验表明白及多糖能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及黑曲霉菌，并随着白及多糖浓度的增加抑制效果增强，白及多糖对细菌的抑制作用强于真菌。