Th17和Treg细胞在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血中的表达及临床价值

曾丹 王卫政

乙型肝炎病毒感染可诱发急或慢性肝炎、肝硬化、慢加急性肝衰竭等，是引起终末期肝病的关键原因，其分子机制尚不明确[1]。有资料显示，宿主免疫反应在肝脏组织损伤进展中起着重要作用，尤其是辅助T细胞17(T helper cell 17，Th17)和调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)，Th17/Treg比例失衡可能与乙型肝炎病毒感染有关，但目前尚无二者诊断慢性乙型肝炎患者慢加急性肝衰竭风险的报道[2]。基于此，本文分析上述对象Th17、Treg、Th17/Treg表达水平，旨在探讨Th17、Treg在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血中的表达及临床意义，为患者病情进展及预后评估提供辅助手段，报道如下。

资料与方法

一、 一般资料

纳入2016年10月至2018年10月于我院收治的65例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者为合并肝衰竭组，另选取同期收治的40例单纯慢性乙型肝炎患者和40例健康体检者，分别设为单纯慢性乙型肝炎组和正常对照组，所有对象均对本研究知情，且签署同意书，获我院医学伦理委员会批准。纳入标准：(1)慢性乙型肝炎：与《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[3]中慢性乙型肝炎诊断标准相符，均经肝穿刺组织等检查确诊，血清总胆红素为171μmol/L及以上，国际标准化比率为1.5及以上(凝血酶原活动度为40%及以下)；年龄>18岁；(2)慢加急性乙型肝炎肝衰竭：参考《肝衰竭诊治指南(2012年版)》[4]，均处于中期，极度乏力，伴严重消化道症状(如腹胀、呕吐、厌食等)，黄疽进行性加深；存在出血倾向，凝血酶原活动度>20%且≤30%；伴肝性脑病(Ⅱ度以下)和(或)明显腹水；年龄>18岁。排除标准：(1)合并甲、丙、戊型等肝炎病毒感染；(2)合并恶性肿瘤及心、脑、肺等严重原发疾病；(3)伴肝硬化、酒精性肝病、药物性肝炎、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病；(4)患者入组前6个月内行抗病毒及免疫调节治疗、肝移植等；(5)精神疾患；(6)妊娠或哺乳期妇女。合并肝衰竭组65例患者中，男55例，女10例，年龄18～65(44.68±9.57)岁；单纯慢性乙型肝炎组40例患者中，男32例，女8例，年龄18～63(43.57±8.96)岁；正常对照组中男33例，女7例，年龄20～67(45.12±9.10)岁。

二、方法

(一)Th17、Treg、Th17/Treg表达检测 收集空腹外周静脉血，以流式细胞仪(美国BD公司，FACS Calibur型)进行检测。同时，计算Th17/Treg比例。

(二)生化指标检测 采集空腹肘静脉血3～5 mL，离心处理后取上层血清于-20 ℃条件下保存。以全自动生化分析仪(日本Olympus公司，Olympus AU2700型)，检测丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素，试剂由日本Olympus公司提供；以放射免疫法测定甲胎蛋白，试剂盒购自武汉明德生物科技股份有限公司。以全自动血凝分析仪(日本sysmex公司，CA7000型)测定凝血酶原时间，试剂由日本sysmex公司提供。

三、观察指标

观察三组Th17、Treg、Th17/Treg表达水平，并按慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者临床转归情况，将其分为存活组和死亡组，并对比存活组和死亡组Th17、Treg、Th17/Treg表达水平。同时，分析合并肝衰竭组Th17、Treg、Th17/Treg表达水平与丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素及凝血酶原时间、甲胎蛋白的相关性。慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者临床转归判定标准[4]：住院期间，患者临床症状减轻且稳定，总胆红素低于171μmol/L，凝血酶原活动度高于40%，出院后随访3个月患者仍存活，即为存活组；住院期间，患者临床症状并未减轻，总胆红素为171μmol/L及以上，且凝血酶原活动度为40%及以下，出院后随访3个月患者死亡，归为死亡组。

四、 统计学方法

结 果

一、 三组一般资料比较

三组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)；合并肝衰竭组丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间、国际标准化比率、甲胎蛋白显著高于单纯慢性乙型肝炎组(P<0.05)，单纯慢性乙型肝炎组上述指标均显著高于单纯慢性乙型肝炎组(P<0.05)，见表1。

二、三组Th17、Treg、Th17/Treg表达比较

合并肝衰竭组Th17、Th17/Treg表达显著高于单纯慢性乙型肝炎组和正常对照组(P<0.05)，单纯慢性乙型肝炎组Th17表达显著高于正常对照组(P<0.05)；合并肝衰竭组、单纯慢性乙型肝炎组Treg表达虽明显高于正常对照组，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

三、存活组与死亡组Th17、Treg、Th17/Treg表达对比

65例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者出院后随访3个月，发现死亡40例，存活25例。存活组Th17、Th17/Treg表达较死亡组显著下降(P<0.05)，见表3。

四、Th17、Treg、Th17/Treg表达与甲胎蛋白、凝血酶原时间、肝功指标的相关性

经直线相关分析，结果显示，Th17与丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、凝血酶原时间呈正比例关系，Treg与凝血酶原时间呈负比例关系，Th17/Treg与丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、甲胎蛋白呈正比例关系，见表4。

表1 三组一般资料比较[(±s)，n(%)]

注：与合并肝衰竭组比较，①P<0.05；与单纯慢性乙型肝炎组比较，②P<0.05

表2 三组Th17、Treg、Th17/Treg表达比较(±s)

注：与合并肝衰竭组比较，①P<0.05；与单纯慢性乙型肝炎组比较，②P<0.05

表3 存活组与死亡组Th17、Treg、Th17/Treg表达对比(±s)

表4 Th17、Treg、Th17/Treg与甲胎蛋白、凝血酶原时间、肝功指标的相关性

讨 论

慢加急性乙型肝炎肝衰竭属国内常见肝病死亡的原因之一，病情进展迅速，预后较差，与适应性免疫及天然免疫应答紊乱有关，多种细胞(T淋巴细胞、树突状细胞等)参与了该病的发生[5-6]。

本研究结果显示，合并肝衰竭组、单纯慢性乙型肝炎组Th17、Treg表达均明显高于正常对照组，这与沈敏等[7]报道相似，证实Th17、Treg参与乙型肝炎病毒感染病理过程，而Treg表达升高可能会负反馈性调节Th17所致过度免疫应答，使乙型肝炎病毒特异性T细胞应答受阻，从而缓解肝脏炎性反应，预防疾病进一步加重。另外，本研究发现，合并肝衰竭组Th17/Treg表达明显高于单纯慢性乙型肝炎组和正常对照组，提示慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者机体出现Th17/Treg细胞分化失衡且更偏向于Th17，表明免疫功能亢进所致免疫病理损伤参与慢加急性乙型肝炎肝衰竭的发病。此外，本研究中，存活组Th17、Th17/Treg表达明显低于死亡组，提示与存活患者相比，死亡患者机体内免疫反应更加剧烈。慢加急性乙型肝炎肝衰竭存活患者Treg细胞逐渐处于优势地位，经诱导机体免疫应答受抑，可预防肝损害持续加重；而慢加急性乙型肝炎肝衰竭死亡患者机体内Th17/Treg细胞分化失衡加剧，以Th17细胞为主导，诱发持续免疫损伤，引起肝损害进行性加重，最后导致死亡。

本研究结果显示，Th17表达与丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、凝血酶原时间呈正相关，Treg表达与凝血酶原时间呈负相关，且Th17/Treg与丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、甲胎蛋白呈正相关。慢性乙型肝炎演变为慢加急性乙型肝炎肝衰竭，与外周血中Th17、Treg表达有关，且反应肝脏炎症严重性[8]。笔者推测，在慢加急性乙型肝炎肝衰竭发病过程中，促炎因子Th17高表达、Th17/Treg细胞分化失衡与肝细胞炎性坏死有关，证实Th17、Th17/Treg属于肝脏炎性反应程度的灵敏指标，这与患者临床表现(肝脏功能严重障碍，如合成、解毒、排泄、生物转化等)相符。但本研究中，未发现总胆红素与Th17、Treg、Th17/Treg的相关性，可能与样本量偏少等因素有关。