微波辐射预处理提取细风轮菜三萜皂苷工艺及生物活性研究

项振锋，许清遥，程 宏，王小芳，汪亮亮，陈 睿，陈旭波

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

细风轮菜Clinopodium gracile（Benth.）Matsum.为唇形科风轮菜属植物，畲族人民用其治疗毒蛇咬伤，称为野仙草[1]。研究表明风轮菜属植物均含有皂苷、黄酮苷、氨基酸、多糖、酚性成分和挥发油等[2-3]。细风轮菜挥发油中含34种成分，其中倍半萜类化合物占70.49%[4]，其植株中含有丰富的黄酮类化合物、萜类化合物、甾类化合物和皂苷类化合物[5-7]。

风轮菜属植物具备较好的抑菌和抗肿瘤细胞活性。如：C.vulgare体积分数为5%的乙醇提取物及体积分数为5%的丙二醇提取物对金葡菌具有较强的活性[8]；C.ascendens精油对多种细菌，如大肠杆菌、农杆菌、金黄色葡萄球菌有显著活性[9]；C.vulgare的乙醇、乙酸乙酯和丙酮提取物与庆大霉素、头孢氨苄在抗菌活性方面具有协同效应。微量稀释法显示其提取物的MIC活性范围为0.625～20 mg/mL[10]。中药植物风轮菜（断血流）水浸液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，其次是大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念球菌[11]。研究指出小鼠灌胃荫风轮浸膏1.2 g/kg，可明显提高钴60照射后的存活率[7]；C.vulgareL.具有较强的抗A2058、HEp-2和L5178Y等肿瘤细胞活性，其IC50分别为20、10、17.8 μg/mL[12]。因此，细风轮菜活性成分的抑菌和细胞活性值得研究。

综上所述，同属植物提取物的生物活性显著，三萜皂苷类是风轮菜属植物的主要活性成分之一[7]。但是，缺乏针对该活性成分的研究，特别是针对畲药细风轮菜活性成分的研究鲜有报道。近年来，微波提取极大地提高了三萜皂苷类等成分的提取效率，微波功率在提取因素中占据着重要的位置[13-15]。因此，有必要研究其活性成分提取的工艺条件，并在此基础上，研究三萜皂苷类等主要活性成分的抑菌、抗肿瘤细胞等活性[5,7]，为后续的研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野外采集细风轮菜全草，阴干，用打粉机打成粉，过40目筛，备用。菌种来自丽水学院医学与健康学院，不同种类细胞来自丽水学院生态实验中心。

齐墩果酸标准品（合肥博美生物科技有限责任公司）、高氯酸（天津政成化学制品有限公司）、香草醛（合肥博美生物科技有限责任公司）、冰乙酸（天津市大茂化学试剂厂）、无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）、正丁醇（天津市福晨化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

Grant SUB Aqua 12 Plus 水浴锅（Grant Instruments（Cambridge）Ltd）、Galanz P70F20CN3P-SR（WO）型微波炉（广东格兰仕微波生活电器制造有限公司）、SHZ-95B真空泵（上海鹰迪仪器设备有限公司）、721型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 三萜皂苷类化合物提取液获得

控制微波时间、功率、汽化剂用量、浸润时间对样品进行预处理。加入70%乙醇溶液（1:25 g/mL），60～65℃恒温水浴提取90 min，抽滤除渣，得三萜皂苷类提取液，待测[16]。浓缩提取液，用水饱和的正丁醇萃取，回收正丁醇，得到三萜皂苷类提取物[17]。

1.3.2 三萜皂苷类化合物提取率的测定

三萜皂苷类含量的测定采用5%香草醛-冰醋酸显色法[16]。通过实验确定最佳扫描波长为550 nm，最佳5%香草醛-冰醋酸用量为0.3 mL，最佳高氯酸用量为0.8 mL。以齐墩果酸含量μg为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据回归方程计算三萜皂苷类含量。三萜皂苷类得率（mg/g）计算公式：

其中：a为三萜皂苷类含量（μg）；V为提取液体积（mL）；v为显色反应提取液体积0.5 mL；w为样品粉末质量5 g。

1.3.3 单因素实验

以细风轮菜三萜皂苷类化合物得率为指标，选择浸润时间、汽化剂用量、微波功率和微波时间进行单因素实验，实验设计见表1。

表1 单因素实验

1.3.4 响应面实验

依据单因素实验结果进行响应面实验水平设计，以三萜皂苷类得率为响应值进行四因素三水平设计，响应面水平及编码见表2。

表2 Box-Behnken设计因素水平及编码

1.3.5 抑菌活性测定

抑菌活性参考CLSI推荐的琼脂稀释法[18]。以铜绿假单胞菌（标准、耐药）、金黄色葡萄球菌（标准、耐药）、大肠杆菌（标准）等5种菌为试验菌进行抑菌活性研究。三萜皂苷类提取液的母液浓度为10 mg/mL，等比稀释。

1.3.6 抗肿瘤细胞活性测定

以人结肠癌细胞（RKO）、人回盲肠癌细胞（HCT-8）、人肺癌细胞（A549）、人结肠癌细胞（HT29）、人肝癌细胞（HepG2）等5种癌细胞为对象进行抗肿瘤细胞活性研究。测定方法参考王涛等人的研究及大连美伦生物技术有限公司提供的试剂盒法[19]。母液浓度为400 μg/mL，等比稀释成5个梯度，实验重复5次，取其中3次分析其活性。

1.3.7 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6.1对数据进行分析与统计。

2 结果与分析

2.1 三萜皂苷类标准曲线制作

由图1可知，三萜皂苷类标准曲线方程为y=0.006 6x-0.007 4，R2=0.999 6，线性关系均较好。

图1 三萜皂苷类标准曲线

2.2 三萜皂苷类提取工艺单因素实验

由图2可知，三萜皂苷类提取率最佳浸润时间为10 min，由图3、图4可知，三萜皂苷类提取的最佳微波辐射时间为60 s，最佳微波功率为280 W，提取率较最低点分别提高了11.404%和18.826%。由图5可知，汽化剂用量对三萜皂苷的提取率也产生了一定的影响，最佳汽化剂用量为5 mL。

图2 浸润时间对三萜皂苷类得率的影响

图3 微波功率对三萜皂苷类得率的影响

图4 微波时间对三萜皂苷类得率的影响

图5 汽化剂用量对三萜皂苷类得率的影响

2.3 响应曲面结果与分析

2.3.1 三萜皂苷类提取率二次响应面回归模型的建立与分析

对表3数据进行多元回归拟合分析，得到三萜皂苷类得率与四因素的回归模型：

表3 响应面实验设计与结果

由表 4可知，回归模型差异极其显著（P＜0.000 1），失拟项（Lack of Fit）差异不显著（P＞0.05），说明方程对试验有较好的拟合性，试验误差较小；R2=0.952 2，R2Adj=0.904 3，也表明模型拟合程度较好；变异系数（CV）=1.33%，说明模型的重现性很好，该模型可以对细风轮菜三萜皂苷类得率进行分析和预测。由F值可知，各因素对细风轮菜总三萜皂苷类得率的影响主次为：汽化剂用量＞浸润时间＞微波功率＞微波辐射时间。

由于各个因素的交互作用并不显著，因此，文中不列出响应曲面图。

表4 回归模型方差分析

2.3.2 三萜皂苷类提取工艺的确定与验证

根据回归模型及软件分析得出，微波辐射处理细风轮菜总三萜皂苷类的最优条件为：浸润时间12.244 min、微波辐射时间59.910 s、微波功率277.315 W、汽化剂用量6.656 mL。将最佳工艺参数修正为浸润时间12 min、微波辐射时间60s、微波功率280 W、汽化剂用量5 mL。该条件下三萜皂苷类得率的预测值为24.157 mg/g（提取率为2.416%）。在此条件下进行3次平行实验，总三萜皂苷类的得率为24.321 mg/g（提取率为2.432%），提取率实际值与预测值相差0.016%。说明该模型能很好地反映细风轮菜总三萜皂苷类的提取条件。传统水浴（去微波）的得率为21.530 mg/g。优化后的得率较传统水浴提高了12.963%，详见表5。

表5 细风轮菜三萜皂苷提取工艺的验证及方法比较

2.4 细风轮菜三萜皂苷类提取物的抑菌活性

由表6可知，三萜皂苷类提取物对3种细菌均有抑制作用，特别对金黄色葡萄球菌（耐药）表现出了较好的活性，其MIC为5 mg/mL。

表6 细风轮菜三萜皂苷类提取物的最低抑菌浓度（MIC,mg/mL）

2.5 细风轮菜三萜皂苷类提取物的抗肿瘤细胞活性

方差分析显示，细风轮菜三萜皂苷类提取物对细胞增殖的抑制率在不同癌细胞及浓度之间均存在极显著差异（P＜0.01）。由表7可知，活性成分对A549和HT29细胞的抑制率高于其它癌细胞。高浓度活性成分对HepG2具有一定保护作用。

表7 细风轮菜三萜皂苷类提取物对5种肿瘤细胞增殖的抑制率（%）

3 讨论与结论

目前的微波辅助提取是将微波直接引入提取设备中，由于溶剂的吸收作用，会降低提取率。本实验采用的是对材料进行微波辐射预处理，破坏植物细胞壁，提高提取效率。实验表明，高功率的微波和较长的辐射时间均能造成材料的活性成分破坏，大量的汽化剂用量和较长的浸润时间均能阻止微波的吸收，前者结论与王亚红等人的研究结论一致[15]。因此，优化微波辐射预处理的提取条件是整个工艺的关键所在。

实验表明，细风轮菜三萜皂苷类提取物对金葡菌及其耐药菌和大肠杆菌均有一定的抑制作用。其对革兰氏阳性菌和阴性菌（标准菌）的抑制效果相当，这与孟庆然的研究结果（皂苷类对革兰氏阴性菌的抑菌能力强于阳性菌）[20]和廖建良的研究结果（皂苷类对革兰氏的阳性菌抑菌能力强于阴性菌）[21]不一致，这与不同来源的皂苷类化合物的复杂性以及提取物中其它化合物与皂苷相互作用导致了结果的差异有关[20]。细风轮菜三萜皂苷类提取物表现出对金葡菌耐药菌较强的抑菌活性，值得进一步深入研究。

研究结果显示，当浓度为400 μg/mL时，活性成分对HepG2增殖均有促进作用，支持了朱俊杰等人关于大青叶提取物对HepG2细胞的保护作用的研究结果[22]。