响应面法优化矮地茶中3种有效成分提取工艺

肖鹏飞，王良贵，张 新，艾雨欣，代 青

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

矮地茶为紫金牛科紫金牛属植物紫金牛Ardisia japonica的干燥全株，常用于新久咳嗽、喘满痰多、湿热黄疽、经闭瘀阻、风湿痹痛和跌打损伤的治疗[1]。矮地茶中主要有效成分岩白菜素、槲皮素与山奈酚等与其临床药理密切相关[2]。因此，探究矮地茶中主要有效成分的提取工艺可为其质量控制与综合利用提供实验基础。响应面优化法以其好预测性、实验简单、高效等特点在中药提取、中药制剂工艺、中药处方筛选等方面得到很好应用[3－4]。黄懿等报道了应用响应面优化矮地茶中多糖提取工艺[5]，但以矮地茶中岩白菜素、槲皮素与山奈酚为提取对象的工艺优化还未见报道。因此，本文以矮地茶中岩白菜素、槲皮素与山奈酚提取率的综合评分为指标，基于单因素试验结果，以星点设计-响应面法优化矮地茶中有效成分提取工艺，为矮地茶综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生的新鲜矮地茶全株于2016年11月从浙江丽水莲都区药农处购得，经主任中药师鉴定为紫金牛科植物紫金牛，然后以去离子水清净、60℃真空烘干、粉碎、过80目筛后备用。

Agilent 1100型高效液相色谱仪（20 μL定量进样环、Extend-C185μm、4.6 mm×250 mm色谱柱（美国安捷伦公司））；KQ-250DE型数控超声波清洗器（总功率250 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；槲皮素对照品（批号：100081-200907）、岩白菜素对照品（批号：111532-201203）购于中国食品药品检定研究院；山奈酚对照品（百灵威科技有限公司，纯度98%），甲醇、乙腈（色谱纯，美国（TEDIA）天地试剂公司），水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

预实验及参考相关文献[6-8]确定测定槲皮素色谱条件为流动相乙腈-0.4%冰醋酸水溶液（60:40，V/V），检测波长372 nm；岩白菜素测定条件为流动相甲醇-水（35:65，V/V），检测波长274 nm；山奈酚测定条件为流动相乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（40:60，V/V），检测波长359 nm，进样量20 μL，流动相流速1.0 mL·min-1，柱温为室温。

1.2.2 对照品溶液的制备

以甲醇为溶剂配制浓度分别为 23.00、11.50、2.300、1.150、0.5750、0.2875 mg·L-1槲皮素对照品溶液，12.00、4.800、2.400、1.200、0.6000 mg·L-1山奈酚对照品溶液；以甲醇 - 水（2：1，V/V） 为溶剂配制 10.42、4.170、2.083、1.042、0.5210 mg·L-1岩白菜素对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液制备

精密称取矮地茶粉末1.0 g，置于具塞碘量瓶中，加入20 mL所选提取剂，置于37℃水浴浸泡0.5 h，以所选功率超声处理45 min，G5砂芯漏斗过滤，滤渣重复提取1次，过滤，合并滤液，以提取剂定容到50 mL，从中准确移取25 mL到100 mL圆底烧瓶中，加5%盐酸10 mL及甲醇5 mL，回流至无沉淀产生，旋蒸近干，氮气吹干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，混匀，过0.45 μm有机滤膜即为供试品溶液。

1.3 分析方法精密度和稳定性试验

对1.2.3项供试液按1.2.1项色谱条件连续分析5次，依色谱图中槲皮素、山奈酚和岩白菜素的相应色谱峰面积计算三者峰面积的相对标准偏差值RSDs。分别在0、2、4、6、8、12 h按1.2.1项条件分析同一供试液，记录槲皮素、山奈酚和岩白菜素色谱峰面积，计算三者峰面积的RSDs。

1.4 回收率试验

分别准确称取6份已知含量矮地茶粉末0.5 g于具塞锥形瓶中，精密加入相当质量的槲皮素、山奈酚和岩白菜素对照品，按1.2.3项制备供试液和1.2.1项分析，计算槲皮素、山奈酚和岩白菜素平均回收率以及相应RSDs。

1.5 单因素试验

分别以提取时间（min）、提取温度（℃）、液料比（mL·g-1）、超声功率（W）和提取剂乙醇浓度（%，体积分数）为考察因素，观察变化其中一个因素对槲皮素、岩白菜素和山奈酚提取率的影响。参照方法1.2.3制备供试品溶液，按1.2.1项进行分析。提取率（P%）表达式为：

1.6 CCD-RSM优化提取工艺

基于CCD-RSM试验精度高、数学模型预测性好的特性[9-10]，在单因素试验基础上应用Design-Expert10.0.3.1软件中CCD-RSM设计了5因素［提取时间X1（min）、提取温度X2（℃）、液料比X3（mL·g-1）、超声功率X4（W）和乙醇浓度X5（%，体积分数）］5水平表（见表1）。以槲皮素提取率（PQ）、岩白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）为基础计算综合因子C[11]：

式中，10，60，30 为相应有效成分加权系数，CQ、CB、CK分别代表 C槲皮素、C岩白菜素和 C山奈酚，其中 Ci＝Pi/Pimax。

表1 因素水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按1.2.1项色谱条件依次分析1.2.2项下对照品溶液，外标法定量，以峰面积A对质量浓度ρ（mg·L-1）进行线性回归，得到回归方程：A槲皮素=-113+881.3 ρ槲皮素（r=0.999 6，线性范围 0.287 5 ～ 23.0 mg·L-1，检出限 0.005 2 μg），A山奈酚=-1.85+70 077.62 ρ山奈酚（r=0.999 5，线性范围 0.60 ～ 24.0 mg·L-1，检出限 0.011 μg），A岩白菜素=0.94+25 863.71 ρ岩白菜素（r=0.999 8，线性范围 0.521 ～ 20.83 mg·L-1，检出限 0.002 8μg），色谱图如图1。由图1中3种有效成分保留时间的差异可见，在所建立的色谱分析下3种有效成分得到良好分离。

2.2 分析方法精密度和稳定性试验

按1.3项分析方法得到槲皮素、山奈酚和岩白菜素的色谱峰面积RSDs分别为2.11%、1.14%与1.87%，表明仪器精密度良好，三者理论板数均高于1 700。在0、2、4、6、8、12 h时按1.2.1项条件分别分析同一供试液得到槲皮素、山奈酚和岩白菜素峰面积的RSDs分别为2.71%、1.18%和1.64%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

图1 矮地茶3种有效成分HPLC图

2.3 回收率试验

按1.4项获得槲皮素、山奈酚和岩白菜素平均回收率分别为97.08%、107.2%、98.11%，峰面积RSDs分别为2.58%、1.47%和1.53%。

2.4 单因素试验

单因素试验结果见图2。图2显示有效成分的提取率随液料比、乙醇浓度、超声功率、提取温度、提取时间的增大先上升，然后分别在液料比30 mL·g-1、乙醇浓度75%、超声功率225 W、40℃下提取60 min基本达到最大值。图2中（a）、（c）、（e）图显示岩白菜素提取率随提取时间、液料比和乙醇浓度增大而快速上升，说明上述3个因素对岩白菜素提取率的影响大于其他2种有效成分。从单因素试验结果难于比较所考察的5个因素各自对PQ、PB和PK的贡献大小，因素间交互作用对考察目标的贡献不明确。

图2 单因素试验

2.5 CCD-RSM优化

以表1各因素水平按表2试验编号进行实验，PQ、PB、PK和C结果见表2。对表2中C进行多元线性回归拟合，结果显示二阶交互模型拟合好，以各因素实际数值拟合的回归方程为：

C=179.9+6.438X1-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.0709X1X3-0.0381X1X4-0.0111X1X5+0.0314X2X3+0.0888X2X4+0.0312X2X5-0.0218X3X4+0.0178X3X5-5.34×10-3X4X5。

回归方程一次项各项系数绝对值的大小反映了各因素对综合因子C的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由方程可知，对C的影响程度依次为X2＞X1＞X3＞X4＞X5，交互作用影响C的顺序为X2X4＞X1X3＞ X1X4＞ X2X3＞ X2X5＞ X1X2＞ X3X4＞ X3X5＞ X1X5＞X4X5。从方程一次项系数可知，提取时间、液料比对槲皮素提取率、山奈酚提取率呈正相关性，提取温度、超声功率和乙醇浓度则呈负相关性，这与单因素试验结果不同，说明了上述回归方程是各因素综合所得。对该模型进行方差分析及模型系数显著性检验的结果见表3。回归方程中各变量对响应值C影响的显著性用F检验来判定，概率P值越小，则相应变量的显著程度越高，即P＜0.01时影响为高度显著，P＜0.05时影响显著。由表3可知，模型P值均＜0.000 1、失拟项P＞0.05和模型的校正决定系数R2Adj为0.861 5，说明二阶交互模型有极高的显著性，模型拟合度良好；X5、X4、X3、X2和 X2X4、X1X3、X1X4、X2X5、X1X2的 P 值均＜0.05，表明它们对 C 有显著影响。所以，为更清晰表达单个因素和两因素交互作用对试验影响，删除拟合回归方程中的非显著项后得到的回归方程为：

C=179.9-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.070 9X1X3-0.038 1X1X4+0.088 8X2X4+0.031 2X2X5。

对C有显著影响的两因素交互作用三维曲面图见图3。

表2 CCD-RSM试验及其结果

表2 续表

表2 续表

表3 回归统计方差分析结果

图3 显著交互项对C响应面图

优选的提取工艺为1.0 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在32℃水浴、超声功率162 W下提取48 min，预测槲皮素提取率0.003 71%、岩白菜素提取率0.736%、山奈酚提取率0.068 2%，综合因子C为83.32。

2.6 验证试验

称取1.000 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在30℃水浴、超声功率150 W下提取50 min，平行5份，得到槲皮素、岩白菜素和山奈酚平均提取率分别为0.003 35%、0.741%、0.070 2%；RSD分别为3.1%、2.6%、2.8%，综合因子83.75，验证值和预测值误差在±0.3%范围内，无显著性差异，拟合方程可较好地描述评价指标与因素间关系，具有实际价值。

3 结论与讨论

试验结果显示，应用CCD-RSM优选的矮地茶中槲皮素、岩白菜素和山奈酚3种有效成分提取参数具有实际操作性，平行性验证试验说明实验结果与模型预测值无显著性差异，优化建立的数学模型可指导试验实践，为矮地茶中有效成分的综合利用提供技术支持。

矮地茶是许多中药复方制剂中的一味中药，因此探讨矮地茶有效成分的提取工艺有实际意义。由于超声波辅助提取法具有提取效率高、快速、提取成分完全，故本实验采用超声辅助提取。槲皮素、岩白菜素和山奈酚的HPLC分析所用检测波长是对相应的适宜浓度标准品溶液进行190～700 nm全波长扫描后确定的。在制备供试品溶液时，若在测定指标成分含量时直接用提取液进样，由于溶剂效应导致峰变宽、分离效果差。故将提取液旋蒸、N2吹干后用甲醇溶解，既能保证浸膏可全部溶解，又能避免溶剂效应。在以星点设计-响应面法优化矮地茶提取工艺中，本实验采用综合因子评价法，因为结合多个指标的综合因子评价法更贴近中药材的使用实际，避免了单一指标的优选设计的局限性和不确定性。每味药材含有多种化学组份，并且中医理论研究表明，中药材的功效是与其性味密切相关的，而药材的性味是其中多个化学组份综合表现出来的，因此，运用综合因子评价法的提取工艺制备的制剂更符合实际。综合因子C公式中槲皮素提取率（PQ）、岩白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）的权重系数是依据各组份在矮地茶中含量并结合参考文献［12-14］确定的，更具体详实权重系数有待进一步研究。验证实验获得的槲皮素、岩白菜素和山奈酚平均提取率和单因素实验结果有所差异，这是由于验证实验是在多因素二次回归优化所得工艺条件下进行的，是综合性的结果，而单因素试验是线性的单一因素变化的实验结果。