不同分子量透明质酸对肺癌小鼠体内肿瘤生长转移的影响

郝利铭，姜 晶，赵广鑫，李永超，桑 赫，韩雨桐

(1.吉林大学基础医学院,吉林 长春 130021;2.吉林省肿瘤医院,吉林 长春 130012)

透明质酸(hyaluronic acid,HA)广泛分布于细胞间质中，是细胞外基质的重要成员之一。近年来的研究表明，肿瘤细胞周围富含HA，它们大多由肿瘤细胞表达产生。王玲研究显示[1]，天然高分子量HA可抑制肿瘤细胞的生长，这可能与高分子量HA的理化性质有一定关系。此外，Ghatak等研究发现[2]，外源性低分子量HA(分子量约2.5×106Da)在体外可抑制小鼠TA3/st乳腺癌细胞、大鼠C6神经胶质瘤细胞、人HCT克隆瘤细胞及人LX1肺癌细胞生长，抑制率在50%～100%。而HA含量的多少对肿瘤生长同样产生着影响。Bharadwaj等研究发现[3]，HAS3所致过量HA可能诱导并改变前列腺恶性肿瘤细胞生长所需的平衡。

人体内HA是由透明质酸合酶(hyaluronic acid synthase，HAS)与透明质酸酶(hyaluronidase，HAases)共同作用所形成的[4]。HAS是HA在生物合成过程中的关键酶。HAS的功能失调能够导致HA合成下降，促进细胞和组织的生理过程向异常转化。研究表明，在大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌的肿瘤生长、侵袭、转移过程中，HAS起到重要的作用[5]。HAases在肿瘤生长转移过程中也起了重要作用。HAases通过降解肿瘤细胞周围基质中的HA，帮助肿瘤细胞脱离原发肿瘤块；其次，癌细胞还利用HAases降解淋巴和血管基底膜，更容易进入血管内；此外，HAases通过分解转移灶附近的HA，为转移灶的肿瘤细胞迁移与转移提供空间。在所有的HAases分解HA过程中，都会不断产生HA片段。这些HA片段刺激了内皮细胞增殖和新生毛细血管生长，从而促进了肿瘤的扩散[6-7]。

本研究拟通过给C57BL/6肺癌小鼠注射低、中、高三种分子量大小HA溶液，观察不同分子量HA对肺癌小鼠体内肿瘤生长与转移的影响，以探究HA作为注射剂抑制或治疗部分肿瘤的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

C57BL/6健康小鼠50只(SPF级)，雄性，6～8周龄，体重(21.15±0.75)g，长春生物制品所实验动物室提供。小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)细胞，由吉林大学药学院生物化学研究室提供。不同分子量大小的透明质酸钠：0.2×106～0.4×106Da(低分子量)、1.3×106～1.5×106Da(中分子量)、1.8×106～2.2×106Da(高分子量)透明质酸钠，由华熙福瑞达生物医药有限公司提供。本实验所有切片图片均采用EUROStarⅢPlus显微镜行显微摄影。

1.2 肺癌小鼠模型的建立

消化、收集小鼠LLC细胞，离心，去上清，无菌生理盐水洗涤2～3次，制成LLC细胞悬液。将此细胞悬液以0.2 mL/只(细胞含量1×106/mL)分别注入50只健康雄性小鼠大腿右侧腹股沟皮下。注射后小鼠正常饲养21 d，形成米粒大小的肿瘤，第22天开始为小鼠注射HA，注射HA溶液浓度1 g/L[8-9]。

1.3 肺癌小鼠皮下注射HA

将培养的肺癌小鼠模型50只，随机分成低(HA1)、中(HA2)、高(HA3)分子量HA组,生理盐水(NS)组和无注射(CK)组，每组10只。前3组分别在肺癌小鼠右侧腹股沟肿瘤团块的近心端皮下注射低、中、高分子量HA溶液，NS组也于腹股沟处注射生理盐水0.2 mL，每3天注射1次，CK组不进行任何处理。每次给药后称量体重，观察注射局部有无异常状况。第25天处死所有动物，对小鼠的肝、肺、脑、肾以及肿瘤取材、称重。

1.4 小鼠肿瘤生长和转移情况观察

将所取材料投入4%中性甲醛固定24 h。固定后，常规石蜡包埋、切片。切片厚度 5 μm，备用。取上述切片行常规HE染色,并分别进行胱天蛋白酶(caspase)-3、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、HAS2和HAases2免疫组织化学染色。显微镜观察所有肿瘤切片的免疫组化结果，并根据镜下观察的阳性情况将结果分为3级：零级(阴性)记0分、一级(阳性)记1分、二级(强阳性)记3分。以评分的高低显示一个组整体的阳性情况,阳性分数=(b+3c)/(a+b+c)，公式中a、b、c分别代表一组中零级、一级、二级例数。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行t检验和卡方检验。当数据例数足够多时用Pearson卡方分析，当数据例数少或出现个别例数为0时采用Fisher的精确检验。P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各分子量HA的刺激性观察

在小鼠右侧腹股沟皮下注射各分子量HA，48 h后观察局部组织并未出现充血、水肿及硬结等异常变化。提示各分子量HA溶液浓度为1 g/L时安全、无毒性。

2.2 肺癌小鼠主要脏器重量和脏体比

与NS组相比，HA1组和HA3组的肝重量显著增高(P<0.05)，HA3组的肺重量显著增高(P<0.05)，HA3组肝的脏体比显著增高(P<0.05)。其他各组脏器重量和脏体比无显著差异(P>0.05)。

2.3 肺癌小鼠肿瘤转移情况

采用下列评分法进行肺癌小鼠体内肿瘤转移分析：无转移(转移灶数量为0)、普通转移(转移灶数量小于2)和重度转移(转移灶数量大于2)。结果显示：NS组中9例普通转移，1例重度转移，转移率27.8%；HA1组中7例普通转移，3例重度转移，转移率27.8%；HA2组中11例普通转移，2例重度转移，转移率28.1%；HA3组中14例普通转移，6例重度转移，转移率55.6%。HA3组肿瘤转移显著高于NS组(P<0.05)，HA1组与HA2组皆与NS组无显著差异(P>0.05)。

器官转移主要行肝转移，NS组5例普通转移，1例重度转移，重度转移率11.1%;HA1组肝脏5例普通转移，3例重度转移，重度转移率33.3%;HA2组7例普通转移，2例重度转移，重度转移率22.2%;HA3组2例普通转移，6例重度转移，重度转移率66.7%。HA3组肿瘤转移情况比NS组严重，两者相比有统计学意义(P<0.05)。且高分子量HA促进肝转移，而对肺和肾无显著影响(图1)。

图 1 各组肿瘤生长转移情况

2.4 肺癌小鼠肿瘤生长状况

肺癌小鼠肿瘤组织的PCNA免疫组化(图2)评分统计结果显示：HA2组阳性程度显著低于NS组(P<0.05，图3)。HA1组和HA3组皆与NS组无显著差异(P>0.05)。

肺癌小鼠肿瘤组织的caspase-3免疫组化(图4)评分分析结果显示：各种分子量大小HA在一定程度上都可以促进部分肿瘤细胞的凋亡(图5)。

2.5 肺癌小鼠肿瘤周围HAS2与HAases2分析

肺癌小鼠肿瘤组织的HAS2免疫组化评分结果显示：高分子量HA在一定程度上抑制了肿瘤周围HAS的合成(图6、7)。

肺癌小鼠肿瘤组织的HAases2免疫组化评分统计分析结果显示：各分子量大小HA对肿瘤周围HAases的合成并不产生太大影响(图8)

2.6 HAS2染色阳性分数和肿瘤转移率对比

HA3组HAS2阳性分数最低、CK组和NS组最高，提示：高分子量组的HA合成最少，而转移率最高(见图9)。

图 2 各组肿瘤组织PCNA染色

图 3 各组肿瘤PCNA染色阳性程度

图 4 各组肿瘤组织caspase-3染色

图 5 各组肿瘤caspase-3染色阳性程度

图 6 各组肿瘤组织PCNA染色

图 7 各组肿瘤PCNA染色阳性程度

图 8 各组肿瘤组织caspase-3染色

图 9 各组HAS2染色阳性分数和肿瘤转移率对比

3 讨 论

近年来研究表明，HA的含量和分子量大小对癌症的治疗有重要意义。Yamada等研究发现[10]，HA的作用可能与其调节细胞的黏附、运动、生长和分化有关。Bharadwaj的研究结果提示：HAS3上调所致的过量HA可能诱导改变前列腺恶性肿瘤细胞生长所需的平衡。因此，HA分子量大小、肿瘤周围含量的多少，均影响肿瘤的生长与发展。

为探究HA治疗或抑制部分肿瘤的可行性，本研究采用了皮下注射不同大小分子量HA溶液的方法观察肺癌小鼠体内肿瘤在实验过程中的生长与转移情况。

肿瘤的生长是肿瘤细胞的增殖和凋亡综合的结果：当细胞增殖大于凋亡时，表现为肿瘤生长，反之，则抑制肿瘤生长。在肿瘤生长到一定程度时，会出现肿瘤的转移。

肿瘤细胞生长的分析显示：中分子量HA增殖小于凋亡，很好地抑制了肿瘤的生长；而高分子量HA增殖和凋亡相近，对肿瘤生长的抑制作用不明显。所以，从抑制肿瘤生长效果的角度来看，高分子量HA是不及中分子量HA的。

各分子量大小HA的注射，对于肿瘤细胞转移的影响也变得不同。肿瘤细胞转移的结果显示：皮下注射高分子量HA的小鼠，其体内发生了更多肿瘤细胞的转移。从单个器官来看，高分子量HA可能促进了肿瘤细胞向肝脏甚至其他脏器的转移，并且加重了各个脏器的肿瘤转移严重程度。故而外源性高分子量HA对肿瘤不存在治疗和抑制效果，甚至有可能促进了肿瘤的生长与转移。

HA的产生与肿瘤的转移也存在一定的联系。从对肿瘤细胞周围HAS2的分析显示：肿瘤的转移率的增高，与HAS2表达的减少是有着一定相关性的，但这种相关性的机制还并未确定。

综上所述，本实验通过对一系列HA溶液皮下注射的研究，发现了中分子量HA相比于其他两种分子量HA，有着良好的抑制肿瘤生长效果，同时也不会促进肿瘤细胞向其他脏器部位的转移。中分子量HA作为细胞外基质成分,具有无毒、安全性高、结构明确、易于生产和价格便宜等特点。因此本研究提示，中分子量HA可以作为一种新的肿瘤治疗研发方向。但同时，现阶段的研究也存在着局限性。本实验只将HA皮下注射到已有肿瘤的部位周围，而并未探究现实情况中大多数肿瘤生长部位的隐蔽与复杂状况，这为HA的注射与应用带来了挑战与困难。下一步工作将研究中分子量HA可否通过静脉注射，依靠血液抵达目标位置产生作用与效能。