五味枳椇颗粒有效成分提取工艺的研究

王子林，张宏梅，何昌盛，崔佰吉,韩在祺

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

近年来饮酒导致的肝炎、肝硬化等肝损伤类疾病成逐年增长的趋势，给人们的日常生活带来极大的麻烦，也给患者和患者家属带来极大的痛苦。解酒保肝类保健产品对酒精性肝损伤有一定的疗效，在预防和治疗酒精性肝损伤方面起到一定的积极作用，在生活中越来越受到人们的重视。五味枳椇颗粒采用五味子、枳椇、葛根、葛花和甘草为主要原料，添加一定的辅料制备成颗粒制剂，具有抗肝纤维化，恢复肝脏机能，促进胆汁分泌作用，对防止脂肪在肝脏堆积也有一定的疗效[1-5]。本研究通过乙醇回流提取五味枳椇的有效成分，以葛根素、甘草酸铵、五味子醇甲、杨梅素为效标,用高效液相测定其含量，优化最佳提取工艺，为五味枳椇颗粒进一步开发提供理论依据。

1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色色谱仪(日本)；ESJ200-4B电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);R-210旋转蒸发仪(BUCHI公司)；Scientz-12SN冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

葛根、甘草、五味子、葛花均购自吉林市德仁药材行；乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法建立

2.1.1色谱条件

色谱柱：Agilent TC-2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸水溶液(三乙胺调节pH 6.5)，梯度洗脱(0→30→50→60→75 min，86%→20%→20%→86%→86%乙腈)；流速：1.0 mL/min；波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2混合对照品溶液的制备

分别精密称取五味子醇甲2.28 mg、甘草酸铵1.81 mg、葛根素4.78 mg、双氢杨梅素1.28 mg，置于50 mL的容量瓶中，甲醇溶解、定容得混合标准品。

2.1.3供试品溶液的制备

精密称取提取物粉末2.0 g，置50 mL容量瓶中，加40 mL甲醇，超声处理30 min，加甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液、即得。

2.2 单因素考察

将枳椇、葛根、葛花、甘草、五味子按5∶3∶1∶1∶1的比例进行取样，分别对提取中的影响因素提取时间、乙醇浓度和药液比例进行单因素考察，确定影响因素的趋势。

2.2.1提取时间的考察

按处方量称取药材3份，料液比为1∶10，乙醇浓度为70%的条件下，进行提取实验，提取时间分别1.0、2.0、3.0 h,提取液浓缩，冷冻干燥，得提取物粉末，按照“2.1”项下方法进行有效成分的含量测定，同时进行出膏率的检查。结果显示：随着加热时间的增加，含量与出膏率也随之加大，但增加的幅度减小，考虑到能源的利用率，所以2 h为最佳的加热时间。

2.2.2乙醇浓度的考察

按处方量称取药材4份，回流时间为2 h，1∶10料液比例进行提取实验，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%,提取液浓缩，冷冻干燥，得提取物粉末，按照“2.1”项下方法进行有效成分的含量测定，同时进行出膏率的检查。结果可知乙醇浓度为60%时药液的含量最高，出膏率最大，所以最佳的乙醇浓度为60%。

2.2.3液-料比例的考察

按处方量称取药材5份，回流时间为2 h，乙醇浓度为60%，进行六组提取实验，液-料比分别为8、10、12、14、16倍，提取液浓缩，冷冻干燥，得提取物粉末，按照“2.1”项下方法进行有效成分的含量测定，同时进行出膏率的检查。结果显示：料液比为14倍时，药液含量最高，料液比为12倍时，出膏率最大，但料液比过高时浪费资源，当料液比为10倍时，含量和出膏率都接近最大量，所以料液比为10倍时为最佳条件。

2.2.4提取次数的考察

按处方量称取药材3份，在回流时间1.5 h、乙醇浓度为60%、液-料比为10倍的条件下提取，提取液浓缩，冷冻干燥，得提取物粉末，按照“2.1”项下方法进行有效成分的含量测定，同时进行出膏率的检查。结果表明,提取次数增加，有效成分的含量有所增加，但是增加比例不是很大，综合考虑，选择提取2次为本研究的工艺。

2.3 正交设计实验

根据单因素考察的结果,进行3因素3水平正交试验,因素水平见表1,正交实验结果见表2。正交试验表明最佳实验组合为A2B1C3，方差分析表明，因素A为显著因素，因素B、C不显著。但从生产实际出发考虑，C1和C3的实验结果相差不大，但C3加热时间越长，能源消耗较大，同时考虑提取效率问题，所以选C2。因此最佳工艺为A2B1C2,即为乙醇浓度为60%，料液比为10倍，加热时间为2 h。

表 1 因素水平表

表 2 正交实验结果表

注：综合评分=百分含量×0.6+出膏率×0.4

2.4 工艺验证

按处方量称取药材3份，60%的乙醇溶液，8倍量，回流提取2 h，提取2次，提取液浓缩，冷冻干燥，得提取物粉末，按照“2.1”项下方法进行有效成分的含量测定，同时进行出膏率的检查。按照正交实验的最佳条件做3次平行实验，验证实验结果的稳定性，3次实验结果相近，表明稳定性较好达到了质量要求,实验工艺可行。

3 讨 论

在多指标正交实验中，各指标的最优实验方案之间可能存在一定的矛盾，所以在实验中要兼顾各个指标，找出各个指标都较好的方案。综合评分法是根据各个指标的重要性来确定权重或组合系数。本实验中含量占60%，出膏率占40%来评定实验结果，以综合评分法优化的最佳提取工艺提取效率更高。

本研究在考察有效成分提取工艺的过程中,在预实验的过程中进行了可以代表几种原料的有效成分：五味子醇甲、葛根素、双氢杨梅素和甘草酸铵。可以充分显示每种药材在方中的质量分数，对于复杂的多组分保健食品在内控质量和标准提升上具有一定的科学依据，也在本制剂的技术保障上起到一定的作用。同时课题组对于几种有效成分的含量测定方法进行了HPLC的方法学建立，并进行了相应的方法学研究。研究表明该方法快速、简单，方法学验证合理，可以用于作为本制剂中4种有效成分的含量测定。