复方益肝颗粒中活性成分的提取工艺研究

陈东红,黄阿贤

(1.福建省药械联合采购中心,福建 福州 350001；2.福建漳州美利得生物工程公司,福建 漳州 363600)

复方益肝颗粒系漳州美利得生物工程公司拟在原南靖县中医院用于治疗慢性乙肝老验方的基础上研发的中药新制剂。验方是由原福建省名老中医肖子精主任提供的，由苦参(君药)、虎杖、茵陈、白笈、田鸡黄等数味中草药组成的复方制剂(原为水煎剂)。其作为医院制剂用于治疗慢性乙肝50余年，临床上取得较好疗效。本实验是在原处方加以改良，并通过正交试验确立提取工艺。

1 实验材料

1.1 仪 器

薄层色谱仪(上海科哲生化科技公司);AB-8型大孔吸附树脂(天津波鸿树脂科技有限公司);高效硅胶G板100 mm×200 mm(青岛基亿达公司)。

1.2 试药与试剂

复方益肝颗粒(漳州美利得生物工程公司,190926);苦参碱、氧化苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所);苦参、虎杖、茵陈等药材(漳州药材站)。试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层扫描法测定苦参碱

2.1.1苦参药材供试液的制备

称取苦参药材粗粉约1.0 g，置具塞锥形瓶中，加氯仿25 mL、浓氨试液0.5 mL，按文献方法制备，定容到5 mL即得[1-3]。

2.1.2复方益肝胶囊供试品溶液的制备

称取复方益肝颗粒内容物1.0 g,置有塞锥形瓶中，加氯仿15 mL，浓氨试液0.5 mL，按文献方法制备，定容到2 mL即得[1-3]。

2.1.3阴性对照液的制备

取除苦参以外的所有药材，按照样品供试液的制备方法制备阴性对照液。

2.1.4对照品溶液的制备

精密称取苦参碱标准品2.2 mg，加无水乙醇定容于1 mL容量瓶中，制成1.1 g/L对照品溶液。

2.1.5对照品溶液的制备

薄层色谱条件及扫描条件高效硅胶G板100 mm×200 mm，点样后氨熏15 min；异辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水(4.5∶4.5∶6∶0.3)为展开剂，氨预饱和15 min，稀碘化铋钾试液显色，λs=480 nm，λR=650 nm,双波长反射式锯齿扫描。

2.1.6线性关系考察

精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5 μL，点于同一硅胶G薄层板上,依法展开,显色,扫描测定。以点样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。回归方程为γ=-23 899.6+72 406.3X(r=0.9989，n=5)。苦参碱在1.17～5.83 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7对照品溶液的制备

测定方法精密吸取对照品溶液1 μL和2 μL,苦参药材供试液2 μL，复方益肝颗粒供试液和阴性对照液各1.5 μL，按标准曲线项下点样，展开，扫描，Rf=0.65，用外标一点法计算含量。

2.1.8回收率试验

精密吸取已知含量的样品3次，分别加入对照品适量，点样展开，扫描测定。结果平均回收率98.81%，RSD1.95%，实验表明回收率良好。

2.1.9精密度试验

精密吸取对照品溶液1 μL，按标准曲线方法重复点样5次，展开，扫描，峰面积的RSD=1.37%。

2.2 正交试验

2.2.1因素水平表的研究

参照预实验结果，在各提取条件中，水用量﹑提取时间、提取次数对提取的浸膏得率有一定影响。在水平分布的选择时，中间水平实验的浸膏得率(9倍量水提取2次，每次2 h)在每一组中均超过了85%，同时考察提取条件对苦参碱指标成分的影响概况，故按表1进行L9(34)正交试验。

按处方比例取各药材(水浸泡30 min),按正交试验条件加水加热提取数次,滤过,合并滤液,定容于50 mL容量瓶中备用。

表 1 正交试验因素水平表

2.2.2苦参正交试验样品测定

量取正交提取液各5 mL于分液漏斗中，加入浓氨水2 mL，参照文献方法制备供试品液[2-3]，定容为约1 mL。取供试品液2 μL照上述测定方法测定。正交试验分析表见表2。方差分析表明，各因素对苦参碱提取含量无显著性影响。

实验中发现苦参药材水提物中既含有苦参碱，也含有氧化苦参碱，但在本复方制剂中无法检测到氧化苦参碱(图1,色谱条件：高效硅胶G板10 cm×20 cm，点样后氨熏15 min；展开剂为氯仿-甲醇-氨水=8∶1∶0.2，稀碘化铋钾试液显色)；提示可能有氧化苦参碱逐渐向苦参碱转化。

表 2 L9(34)苦参碱正交试验分析表

3 讨 论

本实验选择苦参碱为复方益肝颗粒剂中君药苦参含量测定的指标成分之一，可作为辅助控制该剂型的质量标准。薄层扫描检测苦参碱时发现，在苦参碱对照品相应位置，后者的斑点较大，说明后者提取效率更高，故采用第二种提取方法[2-3]。

1.苦参药材,2.复方益肝颗粒,3.样品,4.氧化苦参碱

由于苦参碱中含有多种生物碱,在薄层色谱中分离较为困难。本实验采用氯仿-甲醇-氨水、环己烷-氯仿-甲醇-氨水、环己烷-氯仿-丙酮-甲醇-氨水、异辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水等多种展开剂，结果表明,以异辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水为展开剂,可使苦参碱与其他,碱类成分分离完好,斑点清晰。本法可为复方中药制剂中苦参碱测定提供参考[4-6]。

正交试验表明水用量、提取时间及次数3个因素对本处方中苦参碱含量均无显著影响,因此其最佳工艺将根据配方中另一指标成分虎杖苷含量的测定结果再确定。