PurH基因在大蒲莲猪及其杂交后代肌肉中表达及其与肌苷酸含量关联分析

2020-05-09朱荣生王怀中刘俊珍呼红梅

家畜生态学报 2020年4期

朱荣生，王怀中，刘俊珍，呼红梅*

(1. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 2501100；2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；3.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)

肌苷酸(inosine monophosphate acid，IMP)是肉质鲜味的主要成分，国际上已将其作为衡量肉质鲜味的一项重要指标[1-2]。肌苷酸在动物体内的合成代谢过程十分复杂，其从头合成共涉及10步反应，其中氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶/次黄嘌呤核苷酸环化水解酶(fused IMP cyclohydrolase/phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase，PurH)是催化第9步和第10步反应的酶，对IMP合成具有关键调控作用[3-5]。大蒲莲猪虽然生长速度慢，但以肉质鲜美而著称，是国家级重点保护地方品种。引进猪种杜洛克和长白猪虽然个体大、生长速度快，但风味较差。研究大蒲莲及其杂交组合猪PurH基因的表达差异及其与肌苷酸含量的关系，对进一步了解猪肌肉风味物质形成机理及肉质改良与育种具有一定的理论和实践意义。国内外目前对肌苷酸代谢的研究主要集中于鸡、鱼、猪，对各品种之间肌苷酸含量差异的研究大多只限于统计学方面的分析，发现品种、性别、年龄、饲料和肌肉储存条件等对肌肉中肌苷酸含量都有一定的影响[6-8]。研究肌苷酸代谢关键酶基因，如AMPD1、ADSL、GARS-AIRS-GART、PurH等基因的多态性，并与肌苷酸含量进行关联分析[9-12]。目前对猪肌肉肌苷酸代谢的研究仅限于应用统计学的方法分析比较品种间肌苷酸含量差异[6,9]，克隆肌苷酸代谢酶基因AMPD1，并分析其变异位点[13-15]。但是对猪品种间肌苷酸变化与mRNA表达水平的研究较少。本研究以具有优异肉质性状的地方猪种大蒲莲猪及其杂交后代为研究对象，在检测肌苷酸含量的基础上，探讨PurH基因表达差异及其与肌苷酸含量的关系，以期在分子水平上探明地方猪鲜味物质形成的机理，为培育优质肉猪提供理论支撑。

1 材料与方法

试验猪饲养试验于2016年1-10月在山东济宁大蒲莲猪原种场进行，屠宰试验在山东银宝食品有限公司进行，肌苷酸含量测定、PurH基因表达量检测等相关试验于2016年11月-2017年2月在山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室进行。

1.1 试验猪的选择和屠宰

选择胎次相近的体重为95.0 kg左右大蒲莲猪(DPL，9月龄)、长白猪×大蒲莲猪(DPL，7月龄)、杜洛克×长白猪×大蒲莲(DLDPL，6月龄)各8头，参照《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》[16]的方法进行屠宰，屠宰后30 min取最后肋骨处背最长肌，测定肌苷酸含量，同时用无菌剪刀取最后肋骨处背最长肌，迅速放入液氮中速冻保存。

1.2 肌苷酸含量测定

取0.2 g背最长肌，液氮研碎，用5%高氯酸转入50 mL容量瓶。静置10 min，取上清10 mL，用0.5mol/L NaOH调pH值，转入50 mL容量瓶，并用蒸馏水定容。取1.5 mL 4 ℃条件下15 000 r/min离心10 min(Eppendorf Centrifuge 5415R)，上清过0.45 μm滤膜(MILLEX GP)，用于HCLP(Waters e2695 Separations Module，Waters 2489 UV/Visible Detector)分析。使用C18 (250×4.6 mm) 色谱柱和Waters2489紫外双波长检测器，检测波长为254 nm[1，6]。

1.3 总RNA提取及逆转录

利用RNAiso Plus(TaKaRa)试剂进行肌肉样品总RNA提取。提取的总RNA，经0.8%变性琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计(赛默飞)检测RNA的质量和浓度。取1 μg左右的RNA，先利用The PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(RR047A，Takara)试剂盒中的gDNA Eraser降解RNA中残留的DNA，以避免RNA中可能残留的DNA对目的基因表达定量结果的影响，再利用该试剂盒中的PrimeScript RT Enzyme逆转录RNA为cDNA。

1.4 引物设计合成和荧光定量PCR

根据相关文献报道，选择11个不同功能的常用内参基因，包括ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL4、TOP2B、HMBS、HPRT1、SDHA、YWHAZ和PPIA，作为候选内参基因进行表达稳定性分析。基因PurH根据NCBI上登载的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，内参基因均使用参考文献报道的引物序列[17-20]，候选基因引物自行设计，由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。内参基因、候选基因的具体信息详见表1。

1.5 数据分析

内参基因的分析：在Excel中设定不同样本中某一参考基因Ct值最小者为1，其他样本中参考基因的相对表达量则为2-ΔCt(ΔCt=样本Ct值-最小Ct)，将这些数据导入geNorm V3.5，对各候选内参基因进行稳定性评价[19，21]。被检测基因在大蒲莲猪、长白×大蒲莲猪和杜洛克×长白×大蒲莲猪的相对表达量用2-ΔCt表示(ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因)，目的基因的表达量为内参基因的2-ΔCt倍，ΔCt>0表示目的基因的表达量小于内参基因的表达量；而ΔCt<0表示目的基因的表达量大于内参基因的表达量。

采用SPSS 19.0中的One Way ANOVA模块分析肌肉中肌苷酸含量和肌苷酸代谢关键酶基因表达量的品种效应，并进行方差分析和显著性检验。统计分析数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 RNA质量检测和荧光定量PCR体系的建立

经0.8%变性琼脂糖凝胶电泳，RNA的3条带(28S、18S和5S)清晰，证明其完整性较好。紫外分光光度计检测结果表明，肌肉总RNA的A260/A280为1.96±0.02，浓度为260.6±62.8 ng/μL，表明RNA样品质量良好，适合进行qPCR。

目的基因和内参基因的扩增曲线均呈典型的“S”型，融解曲线在85～90 ℃之间出现标准的单峰，其他位置未有任何峰出现。PCR扩增后绘制每个目标基因的标准曲线，通过计算得知，目的基因和内参基因的标准曲线的扩增效率变化范围在0.95～1.1之间，符合利用相对定量分析法进行表达量分析的要求。

表1 基因引物及信息Table 1 Detail information of genes and primers

2.2 内参基因分析

利用qPCR方法测定24头猪肌肉11个内参基因的Ct值，然后应用geNorm程序对候选内参基因进行稳定性评价。计算基因表达稳定度(M值)，对内参基因表达稳定度进行排序(M值越小，表达越稳定)，并通过依次剔除表达最不稳定的内参基因计算剩余内参基因表达稳定度平均值，计算最稳定的2个内参基因的平均表达稳定度均值。

geNorm 软件评价分析显示，11个内参基因稳定性平均值M 从大到小依次为：SDHA(0.770)>B2M(0.676)>PPIA(0.582)>TBP(0.556)>GAPDH(0.489)>ACTB(0.479)>HPRT1(0.462)>TOP2B(0.440)>HMBS(0.438)>YWHAZ(0.402)>RPL4(0.390)。由此可见，本研究中稳定性最好的内参基因的是RPL4，最差的是SDHA。11个候选内参基因的稳定性M值的平均值为0.517，去掉稳定性最差的一个内参基因，重新计算其余10个内参基因M值的平均值为0.460，依次类推可得到最稳定的2个内参基因的M均值为0.193，即YWHAZ和RPL4两个内参引物联合使用可以达到最高的表达稳定性。

GeNorm软件通过分析配对变异V值确定最适内参基因的数量，并选择出最优组合，而不是通常使用单一内参基因。内参基因的配对差异值Vn/n+1分析结果(图1)显示，V2/3=0.094<0.15，说明该试验条件下均无需引入第3个内参基因进行校正，选择两个表达最稳定的内参基因即YWHAZ和RPL4，以二者Ct值几何平均值作为参照可更准确地校正和标准化目标基因的表达。

2.3 肌苷酸含量检测和PurH基因表达

根据以上内参基因的筛选结果，选择表达稳定性最高的YWHAZ和RPL4基因作为内参基因，以2-ΔCt值表示PurH基因校正后的表达量，其中内参基因的的Ct值为YWHAZ和RPL4基因的几何平均数[21]。利用One Way ANOVA模块对各目的基因表达倍数2-ΔCt进行品种效应分析和多重比较，结果见表2。

由表2可见，DPL、LDPL、DLDPL背最长肌中肌苷酸含量依次降低，DPL肌肉中肌苷酸含量最高，DLDPL肌肉中最低，LDPL次之。DPL背最长肌中肌苷酸含量显著高于DLDPL，提高25.35%(P<0.05)，虽然DPL背最长肌中肌苷酸含量比LDPL增加15.93%，LDPL背最长肌中肌苷酸含量比DLDPL增加8.13%，但差异均不显著(P>0.05)。与DLDPL相比，DPL、 LDPL背最长肌中PurH基因表达量显著增加，而DPL、LDPL间差异不显著。

表2 背最长肌肌苷酸含量和PurH基因表达量Table 2 IMP content and relative expression level of PurH in longissimus dorsi

注：同行数据肩标为相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Notes: In the same row, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

与DLDPL相比，DPL、LDPL肌肉中PurH基因表达量分别显著增加50.00%和25.00%(P<0.05)，虽然DPL肌肉中PurH基因表达量比LDPL增加20%，但差异不显著(P>0.05)。DPL、LDPL、DLDPL肌肉中肌苷酸含量与PurH基因表达量变化趋势一致。

2.4 肌苷酸含量与肌苷酸代谢相关基因表达相关性分析

背最长肌中肌苷酸含量与PurH基因表达量显著正相关，相关系数为0.426(P<0.05)。

3 讨论

荧光定量PCR是一种在转录水平上对mRNA表达量进行定量的方法，具有快速、重复性好和灵敏度高等优点，因此在基因表达的定量研究中获得广泛应用。在对mRNA表达量的分析中，选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数据的关键[22]。大量研究表明任何一种内参基因在所有的试验条件下都不是恒定表达的，在不同类型的细胞、组织中，内参基因的表达都是有变化的[19,22-24]。以前利用猪肌肉为试验材料开展的研究中，稳定表达的内参基因也不完全一致[13,25-26]。本研究首先筛选肌肉中最稳定表达的内参基因，结果表明：11个内参基因中稳定性最好的是RPL4，最差的是SDHA，YWHAZ和RPL4两个内参基因联合使用表达稳定性达到最高，M值仅为0.193。目前大多研究在没有验证内参基因表达稳定性的情况下采用GAPDH或ACTB作为内参基因[19，21]。本研究结果显示这两个内参基因在肌肉中的表达稳定性并不高(M>0.479)。由此可见，不可随意地选择内参基因，需要筛选，这样可以避免试验结果出现偏差甚至错误。

肌苷酸作为衡量肉质鲜味的主要指标，品种间存在差异，莱芜猪、八眉猪、梅山猪等地方品种猪肌肉中肌苷酸含量显著高于引进瘦肉型品种和地方品种与外来猪种的杂交猪[1,27]。本研究结果与此一致，DPL(大蒲莲猪)肌肉中肌苷酸含量最高，DLDPL(杜洛克×长白猪×大蒲莲)最低，LDPL(长白×大蒲莲猪)居中。DPL肌肉中肌苷酸含量显著高于DLDPL，提高25.35%(P<0.05)，虽然比LDPL肌肉肌苷酸含量增加15.93%，但差异不显著(P>0.05)。随着大蒲莲猪血统的减少，肌肉中肌苷酸的含量也随之减少。张淑静等[28]和zhang等[15]研究发现，长白猪肌肉中肌苷酸含量显著高于安徽省地方猪种圩猪和六白猪，与本研究结果以及其它研究结果[1,27]不一致。肌苷酸是畜禽肌肉中重要的风味物质，在动物体内的合成代谢过程十分复杂。畜禽体内IMP 从头合成共涉及 10 步反应，其中PurH基因是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶和次黄嘌呤核苷酸环化水解酶催化活性的双功能酶，催化肌苷酸合成的第9、10两步反应，是肌苷酸合成的关键调控酶[3-5]。在家禽上的研究表明，PurH基因多态性影响肌苷酸含量[5]，PurH基因在肝、脾、脑中的表达量最高，肾、腿肌和胸肌中表达量较高，心、肺中表达量最低[29]，而且不同生长阶段均有表达[30]。PurH基因在生长较慢的地方鸭品种连城白鸭中表达量显著低于引进的樱桃谷鸭及其杂交品种金陵白鸭，而且PurH基因表达量与肌苷酸含量呈线性函数关系，二者之间具有较高相关性[4]。这与本研究结果一致，本研究结果表明，DPL、LDPL肌肉PurH基因表达量分别比DLDPL显著增加50.00%和25.00%(P<0.05)，虽然DPL肌肉中PurH基因表达量比LDPL增加20%，但差异不显著(P>0.05)。DPL、LDPL、DLDPL背最长肌中肌苷酸含量与PurH基因表达量变化趋势一致。而且相关分析发现，肌苷酸含量与PurH基因表达量显著正相关。由此可见，PurH基因的表达对肌苷酸的沉积具有一定程度的影响。

由于DPL、LDPL以及DLDPL的 ADSL相对表达量与其对应组织IMP含量存在显著正相关，而且IMP具有中等遗传力[31]，这对于优质肉猪的选育有极为重要的参考价值，尤其是在 IMP 含量的选择上。在本研究中，PurH基因mRNA表达量在大蒲莲猪不同杂交程度品系间存在显著性差异，表明存在一些关键调控因子参与PurH基因的表达过程。当然在IMP合成过程中还有其它的关键酶参与，一旦对其它酶基因的相对表达量与组织IMP含量间的相关性也能搞清楚，那么将这些酶基因作为侯选基因，就可作为分子标记辅助育种选育出高IMP含量的品种。