猪let-7a靶基因预测及生物信息学分析

张家庆，王献伟，李文嘉,何俊丹，白红杰，陈俊峰，任巧玲，魏成斌，邢宝松*

(1. 河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，郑州 450002；2. 河南省畜牧总站,郑州450008；3 郑州市动物卫生监督所，郑州 450000；4. 河南农业高新技术集团有限公司，郑州 450002；)

卵泡发育成熟排卵或闭锁退化取决于卵泡内颗粒细胞的状态:细胞增殖分化则成熟排卵, 细胞凋亡则卵泡闭锁[1]。猪是多胎动物，在其出生前卵巢内就含有大量的原始卵泡，但在其繁殖期参与排卵的卵泡数量仅占初级卵母细胞总数的0.14%，其余均自行退化闭锁[1-2]。在卵泡期卵巢上约有50%的中等卵泡(3～6 mm)在选择过程中发生闭锁，仅有10～25个卵泡可发育至成熟而排卵[3]。因此，卵泡闭锁是导致排卵率降低的关键因素。目前研究表明，卵泡闭锁的实质是颗粒细胞的凋亡，并已证实有许多基因或转录因子、生殖激素、细胞因子等对颗粒细胞凋亡有直接或间接的调控作用[4]。MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21～23 bp的非编码RNA，可通过结合相应靶基因的3'UTR来调控其转录水平，具有高度的种间保守性[5]，在细胞凋亡、自噬、增殖等生物学进程中起着重要功能[6]。miRNA广泛参与了猪卵泡发育和闭锁的调控过程，如Let-7g可通过靶向作用于MAP3K1从而诱导颗粒细胞的凋亡[7]，miR-378可通过靶向于CYP19基因的表达来调控颗粒细胞中雌二醇的水平[8]，miR-34c可作用于FOXO3来调控猪颗粒细胞的功能[9]。let-7a 是最先被鉴定的miRNA 之一 let-7家族的一员[10]，且在由药物、感染和应激等因素引起的细胞凋亡中具有重要的抗凋亡作用。但对于其参与调控猪卵泡闭锁的研究还十分欠缺。因此，探索let-7a参与猪卵泡闭锁的调控机制具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用卵巢采自郑州市惠济区屠宰场，来自体重约为(125±5 kg)的外三元母猪。卵巢的形态观察及运送方式参照文献[9]。

1.2 分离有腔卵泡

参照文献[11]方法进行有腔卵泡(3～5 mm)分离和形态、质量的鉴定，根据其形态和质量分为健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡3种。

1.3 颗粒细胞及卵泡液分离

单个卵泡经体式显微镜初步鉴定后，使用本课题组发明的一种装置(专利号ZL201720410245.0)分离不同类型卵泡内的卵泡液和颗粒细胞，分离后立即液氮冻存，然后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 生殖激素的测定

单个卵泡液内生殖激素的测定使用猪特异性的孕酮和雌激素ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)，检测前分别使用生理盐水将单个卵泡液进行50倍稀释，稀释混匀后再分别进行E2和P4的浓度测定。

1.5 荧光定量PCR

1.6 颗粒细胞培养及处理

1.6.1 颗粒细胞培养 将采集的颗粒细胞1 000 r/min 离心5 min去除卵泡液；用预热的PBS (37 ℃) 洗涤2次，每次1 000 r/min 离心5 min，去除PBS；用1 mL含有体积分数10%的胎牛血清和双抗的DMEM/F12完全培养基重悬颗粒细胞，接种于T25培养瓶，37 ℃、5%CO2培养箱中培养；12～24 h后观察细胞贴壁情况，未贴壁的颗粒细胞更换新的培养基继续培养，待细胞长至90%汇合度时进行传代，用于后续相关研究。

1.6.2 转染 将上述猪颗粒细胞消化混匀为(1～1.5)×106个/mL的细胞悬液，取0.2 mL细胞悬液分别加入96孔板内，培养6～12 h后进行转染(此时培养基不含双抗)，转染方法参照Lipofectamine2000转染说明书。分为3组，即空白对照组(Blank，未转染组)、阴性对照组( NC，空载体转染组)和转染let-7a mimics组。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，引物序列如下：

ssc-let-7a sense：5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'

ssc-let-7a antisense：5'-CUAUACAACCUACUACCUCAUU-3'

NC sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3'

NC antisense：5'-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3'

1.6.3 H2O2处理 试验分成空白对照组(Blank)、 H2O2组(Blank+H2O2)、阴性对照组(NC)和let-7a组(转染let-7a mimics)4个组，转染48 h后，除Blank组外，其余3组均用150 μmol/L H2O2处理6 h，收集部分样品用于RNA提取和定量分析，部分样品用于细胞活性检测。

1.6.4 MTT检测 H2O2处理6 h后，利用MTT试剂盒(南京建成生物工程研究所)处理细胞，每孔的吸光度测定采用全波长酶标仪进行，波长设定为570 nm，细胞的增殖率与测定的吸光度成正比。

1.7 ssc-let-7a生物信息学分析

1.7.1 TFBS预测 利用NCBI和ensembl数据分别检索ssc-let-7a前体(ssc-let-7a-1和ssc-let-7a-2)，分别取其上游2 kb的碱基序列，然后分别应用PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3),JASPAR CORE Vertebrate (http://jaspardev.genereg.net/) 生物信息在线预测软件对ssc-let-7a 进行转录因子结合位点预测分析。

1.7.2 物种间保守性分析 利用miRBase (Rlease 21，http://www.mirbase.org/) 分别查出猪(Susscrofa, Ssc)、人(Homosapiens, Hsa)、大鼠(Rattusnorvegicus, Rno)、小鼠(Musmusculus, Mmu)、灰仓鼠(Cricetulusgriseus, Cgr)、牛(Bostaurus, Bta)、马(Equuscaballus, Eca)、大猩猩(Gorillagorilla, Ggo)、婆罗州猩猩(Pongopygmaeus, Ppy)、黑猩猩(Pantroglodytes, Ptr)和 猕猴 (Macacamulatta, Mml)的ssc-let-7a成熟序列，并分析各物种间的保守性。

1.7.3 靶基因分析 为分析ssc-let-7a的生物学功能，分别使用TargetScan、miRanda、RNAhybrid 三款软件对ssc-let-7a进行靶基因预测；根据预测结果交集，结合近年来已发表的与ssc-let-7a相关研究，确定其靶基因并进行后续分析。

1.7.4 GO富集性分析 利用数据库(http://www.geneontology.org/)最新猪的注释信息，运用BINGO对其ssc-let-7a靶基因的生物学过程、分子功能和细胞成分进行注释分析；应用超几何检验进行生物学统计，以P≤0.05为阈值，获得显著富集的GO term。

1.7.5 KEGG富集性分析 利用ClueGO(Cytoscape 插件)进行ssc-let-7a的KEGG通路富集分析，利用超几何检验进行生物学统计，以P≤0.05为阈值，获得显著富集的KEGG通路。

1.8 统计分析

qRT-PCR采用GAPDH基因作为内参，miRNA的定量利用U6作为内参，统计分析按照2-△△Ct方法进行[12]。利用SPSS 17.0中 one-wayANOVA分析方法对基因表达量化进行显著性分析，数据表示为平均值±标准误，P<0.05 定为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同形态卵泡中E2和P4浓度的变化

早期和晚期闭锁卵泡中E2的浓度显著低于健康卵泡(图1A)；P4的水平变化呈现出相反的趋势(图1B)，即早期和晚期闭锁卵泡中的水平显著高于健康卵泡(P<0.05)。当有腔卵泡开始出现轻微闭锁时，E2在卵泡液中的水平开始下调；而卵泡液中P4的水平开始上调，P4/E2之比值与卵泡闭锁程度呈正相关 (图1C)。

2.2 ssc-let-7a在卵泡颗粒细胞中的表达量变化

qRT-PCR检测了ssc-let-7a 在健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁卵泡颗粒细胞中的相对表达量，结果如图2所示，随着卵泡闭锁程度的加深，ssc-let-7a表达量逐渐降低，故推测ssc-let-7a可能颗粒细胞凋亡中起着抗凋亡作用，它的低转录水平可能促进了颗粒细胞凋亡，加速了卵泡闭锁的进程。

2.3 过表达ssc-let-7a对H2O2诱导颗粒细胞氧化损伤的保护作用

MTT结果分析表明，与空白对照组(Blank)相比，H2O2处理组细胞活性显著降低(P<0.05)；与阴性对照(NC)相比较，过表达ssc-let-7a可部分抑制H2O2对颗粒细胞活力的影响(P<0.05)(图3)。与Blank相比，H2O2处理组凋亡相关基因表达显著升高(P<0.05)；与NC相比较，过表达ssc-let-7a可部分抑制H2O2诱导的猪颗粒凋亡相关基因的表达(P<0.05)(图4)，说明过表达ssc-let-7a对H2O2诱导猪颗粒细胞凋亡具有保护作用。

2.4 TFBS分析结果

运用2种生物信息分析软件对ssc-let-7a的前体(见表1)启动子上游2kb区域进行了TFBS预测，结果表明其启动子区域具有叉头转录因子1 (Foxo1)、叉头转录因子3(Foxo3)、叉头/翼状螺旋转录因子3 (Foxp3) 、叉头转录因子4(Foxo4)、p53转录因子、激活子蛋白-1(activatorprotein1,AP-1)、核因子B (Nuclear factor kappa B, NFkB)、信号传导及转录激活因子 (Signal transducers and activators of transcription，STAT)、转录因子GATA-4、解旋酶样转录因子 (HLTF)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)、Smad4、转录因子Sp1(specificity protein1，Sp1)等多个转录因子结合位点，其中Foxo1、Foxo3、p53、NFkB等均参与了猪颗粒细胞凋亡的调节(图5)。

图4 过表达ssc-let-7a对颗粒
细胞凋亡相关基因表达的影响
Fig.4 Effects of ssc-let-7a over-expression on the
expression of apoptosis-related genes in granulosa cells

表1 猪let-7a前体的详细信息Table 1 The details of the pig let-7a precursors

2.5 let-7a保守性分析

利用在线数据库miRBase搜索了包括猪在内的总共11个物种let-7a成熟区序列，具体结果见表2，各物种间let-7a的成熟序列具有高度保守性。

2.6 靶基因预测结果

取TargetScan、miRanda和RNAhybrid 三款软件对ssc-let-7a靶基因预测结果的交集，同时结合文献中报道的靶基因，总共获得278个基因，作为后续GO和KEGG分析的靶基因集合(表3)。

2.7 GO富集结果

对猪let-7a预测的靶基因分别进行功能注释和相应的富集处理，如表4～表6和图4所示，猪let-7a靶基因主要富集于转化生长因子β受体正调控、葡萄糖反应、蛋白稳定性调控和内皮细胞迁移等多个生物学过程(P<0.05)；在细胞组分层面，靶基因显著富集于内体膜的外部组件、中间体和质膜外侧面等相关的GO条目中(P<0.05)；在分子功能层面，靶基因主要富集于蛋白结合、内切酶活性和真核细胞表面结合等相关的GO条目中(P<0.05)。

表2 各物种间let-7a成熟区序列Table 2 The mature sequence of let-7a among species

表3 猪let-7a靶基因的部分成员Table 3 Some members of the target genes of pig let-7a

表4 猪let-7a靶基因的生物学过程(BP)Table 4 The biological process of pig let-7a target genes

表5 猪let-7a靶基因的分子功能(MF)Table 5 The molecular function of pig let-7a target genes

表6 猪let-7a靶基因的细胞组分(CC)Table 6 The cellular component of pig let-7a target genes

2.8 KEGG富集分析

为探明猪let-7a的生物学功能，采用ClueGO对上述预测的靶基因进行相关通路富集，如图7所示，ssc-let-7a靶基因显著富集于RIG-I样受体信号通路、ECM受体相互作用、溶酶体、细胞因子受体相互作用、胞质DNA传感通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路。

3 讨 论

Let-7a是Let-7家族重要成员之一。随着研究的不断深入，众多研究已证实Let-7a在动物生长发育、细胞分化与凋亡等方面发挥着重要的调控作用[10,14]。但目前对Let-7a在猪卵泡闭锁中的时空表达机制的研究还鲜有报道。本研究发现猪卵泡颗粒细胞中Let-7a的表达量与卵泡闭锁程度成反比。健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁中颗粒细胞的表达量变化趋势说明Let-7a与卵泡发育和闭锁有着极为重要的关联。E2和P4的水平对于调控卵泡发育和闭锁起关键调控作用，卵泡液中E2和P4浓度的改变能够表明有腔卵泡内颗粒细胞的生理状况[15]；P4 /E2比值与细胞内核酶的活性呈正相关，其比值能够客观地评判卵泡闭锁的程度[16]。本研究结果显示早期和晚期闭锁卵泡中E2的浓度显著低于健康卵泡，P4的水平变化呈现出相反的趋势，而P4 /E2之比值与卵泡闭锁程度呈正相关。由此可推测类固醇激素表达水平的变化可能会直接或间接下调Let-7a的表达量，这也说明了 Let-7a 的表达水平对于E2和P4调控猪卵泡发育和闭锁可能存在重要的影响。

目前有关 Let-7a的报道主要集中在人类及小动物细胞。例如，在犬流感病毒感染的犬肾细胞中Let-7a作为一种抗凋亡因子起着抗凋亡作用，过表达Let-7a则能够有效地抑制病毒诱导的凋亡，而抑制其表达可促进细胞凋亡[17]。Yu等[18]证实Let-7a可同时靶向Fas和FasL 的3'UTR，通过抑制Let-7a表达可上调Fas和FasL蛋白水平，从而促进骨髓间充质干细胞诱导T细胞凋亡。Tsang等[19]发现在人类癌细胞中Let-7a靶向caspase-3从而调控药物诱导的细胞凋亡。Song等[20]则发现在人支气管上皮细胞暴露PM2.5后，过表达Let-7a能够抑制细胞内ROS水平和凋亡细胞比率。卵泡闭锁的实质是颗粒细胞凋亡，而氧化应激是诱发其凋亡的重要因素[13]。H2O2是一种常用的氧化剂，广泛用于诱导细胞凋亡。本研究采用H2O2诱导猪颗粒细胞凋亡，对ssc-let-7a在不同类型有腔卵泡的颗粒细胞中的表达量进行了分析，并研究了其在正常发育颗粒细胞中的功能，结果发现在体外培养的颗粒细胞中过表达ssc-let-7a能够有效地抑制H2O2诱导的凋亡相关基因的表达，表明过表达ssc-let-7a能够对抗颗粒细胞的氧化损伤，由此可推测Let-7a在猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁中可能起着关键调控作用。

miRNA对靶基因的转录后调控是一个复杂又精确的调控网络，该调控网络在细胞自噬、凋亡、增殖和分化等生物学进程中起关键调控作用[10]。为揭示 Let-7a在猪卵泡闭锁中的作用，本研究对三款软件预测的交集靶基因进行GO和KEGG相关分析。Let-7a靶基因的GO注释主要显著富集在转化生长因子β受体正调控、葡萄糖反应、参与凋亡半胱氨酸型内肽酶活性的负调控等生物学过程，由此推测Let-7a在猪卵泡闭锁中发挥重要作用。KEGG富集结果显示，Let-7a靶基因显著富集在细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、TGF-β等信号通路。在预测的候选靶基因中，3个靶基因和细胞凋亡有着密切的联系，它们分别是TP53、FAS和CASP3，其主要参与MAPK信号通路、P53信号通路等细胞凋亡密切相关通路。Fas 配体受体系统在猪颗粒细胞凋亡中起着重要的作用[21]，FAS/FASL的结合能够诱导细胞凋亡的发生。在宫颈癌研究中，Wang等[24]证实let-7/miR-98可靶向于FAS，而过表达miR-98可下调FAS的表达从而抑制了凋亡过程。Yu等[18]研究表明Let-7a靶向Fas的3'UTR，抑制Let-7a可上调Fas蛋白水平，促进骨髓间充质干细胞诱导T细胞凋亡。CASP3是Caspase家族成员中的关键执行成员，它在内外界因素介导的凋亡途径中起着关键作用。例如，在癌细胞中过表达Let-7a可下调CASP3的表达，抑制Let-7a表达可促进阿霉素诱导的凋亡，而应用CASP3抑制剂可阻止凋亡发生[19]。据此推测，let-7a可能靶向于CASP3和FAS调控其在猪颗粒细胞中表达变化继而调控相应的凋亡通路，这为后续深入研究其对猪卵泡闭锁调控的内在机制提供了重要依据。

4 结 论

通过研究分析let-7a在不同形态的猪卵泡颗粒中的表达量变化，初步明确了let-7a对猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的可能调控机制。通过体外培养及处理研究发现，在猪颗粒细胞中过表达let-7a能够有效地抑制H2O2诱导的凋亡相关基因的表达。通过靶基因预测软件对let-7a靶基因相关通路富集分析发现，let-7a可靶向于凋亡相关基因CASP3和FAS, 因此推测let-7a对猪颗粒细胞凋亡起调控作用很可能是通过靶向CASP3和FAS，继而参与了猪卵泡发育和闭锁的调控。