挤奶厅气载大肠杆菌的分离鉴定及其REP-PCR指纹图谱分型研究

钟召兵，王宁，孙红华，杨夫会

（1.山东省泰安市岱岳区行政审批服务局，泰安 271018；2.山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局，泰安 271018）

乳品营养丰富，是优质的营养食品，同时也是微生物良好的培养基，在生产加工运输过程中极易被微生物污染[1]。大肠杆菌是乳品国家标准中规定的菌群检测项目的主要目标物，且是食品级饮用水受粪源污染的重要微生物学指标[2]。

挤奶厅的空气质量对原料乳的质量有着重要的影响，因此从挤奶厅中分离大肠杆菌不仅可以为评估微生物污染提供有价值的信息，其基因分型还可以用于乳及乳产品生产过程中污染源的追踪[3]。近年来随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的发展，出现了一系列的分子生物学分型方法[4]。在通过PCR扩增细菌基因外的重复DNA片段获得的菌株特异性遗传图谱中，其中重复DNA片段包含了一个高度保守的回文序列（repetitive extragenic palindromic elements, REP），以肠杆菌科基因重复序列为引物进行PCR，能扩增出多态性的DNA图谱[5]。通过对指纹图谱进行综合分析，获得其相似指数，能准确地反映菌株间DNA基因组的异同，能区别含有这些重复序列的不同菌种或菌株，因此具有很强的鉴别种乃至菌株的能力[6]。REP-PCR作为一种行之有效的分子分型技术，已经被作为一种流行病学调查方法[7]。

本研究从28个生鲜乳收购站的挤奶厅空气中分离气载大肠杆菌，通过菌株的REP-PCR指纹图谱分析分离株的同源性，旨在为生鲜乳及乳制品生产源头上控制大肠杆菌污染及追踪污染源提供一种有效的技术方法。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

采用国际标准的ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器（Andersen，1958）[8]，将其置于挤奶厅中央，高度为1m，空气流量是28.31m3/min，以血琼脂培养基为采样介质，驱动时间根据不同卫生条件在1～5min之间。

1.2 主要试剂及仪器

缓冲蛋白胨水、肉汤培养基、伊红美蓝琼脂、麦康凯3号琼脂（Oxoid）等。REP1:(3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和REP2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)由大连宝生物公司合成；TaqDNA聚合酶PCR反应试剂为大连宝生物公司产品。

培养皿，高压蒸汽灭菌锅，Eppendorf PCR扩增仪（AG22331），上海天能科技有限公司凝胶成像系统（tanon-2500）。电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶自动成像（Biorad，意大利）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；恒温培养箱（上海实验仪器总厂）。

1.3 大肠杆菌培养、分离鉴定

采集的样本在37℃条件下培养24h后，所有的阳性菌落经过“KOH 反应”试验鉴定其是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌在血琼脂培养基（杭州天河，批号180227）上进行一次分离培养。然后在伊红美蓝琼脂培养基平板上37℃培养18～24h；挑取黑色金属闪光的菌落，再次接种麦康凯3号琼脂培养基（Oxoid）平板，37℃恒温培养过夜。用API 20 E（Bio Merieux, Marcy-I’Etoile, France）鉴定。

1.4 菌体DNA提取

将大肠杆菌接种到5mL LB培养基（Oxoid）中振荡培养18h。然后取出培养液置于1.5mL Ep管中，10000×g离心2min，弃上清，用100μLTE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH 8.0）悬浮沉淀，在100℃条件下煮沸10min，再迅速冰浴5min，最后12000×g离心2min后，取上清液作为模板，在-20℃条件下保存备用。

1.5 REP-PCR 反应

使用含有20个碱基左右的引物通过PCR扩增细菌基因的重复DNA片段来获得菌株特异性图谱，用计算机对图谱进行综合分析，观察菌株间基因组差异。

REP-PCR反应体系为25μL：1×TAE缓冲液，1.5mmol/L MgCl2(TaKaRa)，0.875mmol/μL dNTP，1.5U Taq DNA聚合酶，引物各300ng/μL，2μL模板DNA，最后用灭菌双蒸水补充至25μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，51℃复性1min，72℃延伸3min，共32个循环，最后72℃延伸16min结束反应。

PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，用透射紫外灯观查结果和照相。为了减少误差，所有分离菌的REP-PCR均在同一反应条件下一次完成，反应产物加样于同一块凝胶中进行电泳。

1.6 REP-PCR指纹分析

记录扩增产物的电泳谱带。样品有扩增带赋值为“1”，无扩增带赋值为“0”，用电泳图象分析软件（Gel Image System, Version 4.00）进行分析，采用非加权对数算术平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA）、利用NTSYS-pc 2.10软件构建聚类树状图，进行聚类分析。每一个分离株看作是一个分类学单位（Operational Taxonomic Unit,OTU），并且把≥90%相似性的菌株看作是一个分离株[9]。

2 结果

2.1 气载大肠杆菌分离鉴定

95份样品中，有23份分离到大肠杆菌，共16株，阳性率平均24.21%（表1）。

表1 挤奶厅气载大肠杆菌的分离情况

2.2 REP-PCR鉴定

用REP-PCR方法对从挤奶厅分离的气载大肠杆菌进行扩增，根据电泳谱带绘制的UPGMA遗传进化树（图1），16株气载大肠杆菌共分为13种基因型，分别是A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M。它们之间的同源性在57%～92%之间，大部分菌株间相似性低于90%，同源性大于90%的只有菌株3和4、7和8以及9与10（图1）。

图1 16株气载大肠杆菌的REP-PCR聚类图

3 讨论

现代原料乳及乳制品的质量安全控制涉及整个供应链（即从农场到餐桌的过程）。在整个供应链当中，奶源是供应链的起点，乳制品是最终产品，这两点是乳品质量安全得以实现的关键[10]。对于过去的最终产品质量合格检验的控制模式已经不能适应现代乳及乳制品质量安全生产的发展。

乳产品质量安全问题严重影响我国乳制品行业发展。造成安全问题的原因是多方面的，其中原料奶生产中所使用的容器及用具，如奶桶、挤奶机、滤乳布和毛巾等不清洁，是造成污染的重要途径。畜舍内飘浮的灰尘中常常含有许多微生物，多数为芽孢杆菌及球菌，此外也含有大量的霉菌孢子，空气中的尘埃落入乳中即可造成污染[11]。

蝇、蚊有时会成为最大的污染源，特别是夏秋季节，由于苍蝇常在垃圾或粪便上停留，所以每个苍蝇体表可存在几百万甚至几亿个细菌，其中包括各种致病菌，当其落入乳中时就可把细菌带入乳中造成污染。乳被饲料中的细菌污染，主要是在挤乳前分发干草时，附着在干草上的细菌（主要是芽孢杆菌，如酪酸芽孢杆菌、枯草杆菌等），随同灰尘、草屑等飞散在厩舍的空气中，既污染了牛体，又污染了所有用具，或挤奶时直接落入奶桶，造成乳的污染[12]。从源头上控制污染已经成为解决乳制品质量安全的关键点，在生鲜乳及乳制品生产中，大肠杆菌超标是一个重要的卫生安全问题[13]。

本研究按照食品卫生微生物学检验-大肠杆菌检验标准对收集的气载大肠杆菌进行分离鉴定，并分析分离株的同源性。结果从95份样品的23份中分离到16株大肠杆菌，其中阳性率为24.21%（23/95）。

REP-PCR是由Versalovic等[14]建立起来的一种菌株鉴定技术，通过PCR扩增细菌基因的重复DNA片段可获得菌株特异性遗传图谱，其中重复DNA片段包含了一个高度保守的回文序列（REP）为38bp的片段，由1个保守回文段以及两端分别有6个降解位点和1个5bp的可变框构成。REP片段中的回文序列以及能形成框架结构的特征是导致其具有高度保守结构等多重功能的关键。通过对扩增形成的DNA片段条带的电泳指纹图谱进行综合分析，获得其相似指数，能准确地反映菌株间DNA基因组的异同。理论上，同种、同型以及具备相同的遗传基因菌株即同源性相同的细菌应具备特异而稳定的DNA指纹图谱，故该方法可应用于不同种、型及细菌菌株的同源性或相似性鉴定。Del Vecchio等[15]用肺炎支原体的RepMP3序列中分离的RW3A为引物，对其进行分型，发现他们的PCR产物有高度的重复性和稳定性。而Vander Zee[16]等比较了Rep-PCR与其他鉴定方法的差异，发现Rep-PCR与PFGE（染色体DNA脉冲场凝胶电泳PFGE）的分析结果一致。因此，REP-PCR作为一种行之有效的分子鉴定分型技术，已被用作一种病原学或分子流行病学调查的研究方法[17]。

本研究利用REP-PCR方法分析16株气载大肠杆菌的指纹图谱，对气载大肠杆菌进行分型，16株菌分为13种基因型，而且各个基因型之间的同源性较低，只有6株两两之间的同源性＞90%。这表明空气中的大肠杆菌来源更为广泛，而且通过克隆传播的可能性较低。这可能与挤奶厅日常管理要求挤奶后清洗消毒，使其空气不适宜细菌繁殖有关。大肠杆菌气源性传播途径往往被人们所忽略。但是本研究的结果表明，挤奶厅环境中的气载大肠杆菌，其基因型多且同源性较低。因此，在实际生产中除了需要清洗消毒外，还应采取定期更换消毒剂等措施来控制大肠杆菌通过空气进行散播。

REP-PCR作为一种分子分型技术，可用于挤奶厅大肠杆菌的检测、基因分型研究及同源性的分析。对控制挤奶厅空气中大肠杆菌的污染，指导生鲜乳及乳制品生产企业从源头上控制大肠杆菌的传播有重要意义。