牛早期胚胎取样对移植妊娠率的影响

蔺惠良，苏硕青，王志仙，赵增元，郭伟婷，朱宏波，冯春涛，余文莉,2

（1.石家庄天泉良种奶牛有限公司，石家庄 050200；2.河北省奶牛良种繁育工程技术研究中心，石家庄 050200；3.石家庄市畜牧技术推广站，石家庄 050000）

随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和快速发展，胚胎移植技术已被广泛应用于牛的遗传育种与良种快速扩繁。PCR胚胎性别鉴定技术的应用使犊牛的性别控制准确率达到98%以上，进一步增强了牛胚胎移植技术的实用性。但从完整胚胎上切取数个卵裂球的操作是否会大幅降低移植妊娠率，是技术的提供者与接受者都十分关注的问题。本文从胚胎类型、质量、发育阶段、取样细胞数及体外存放时间等方面进行深入研究，以期制定并进一步优化提高牛取样后胚胎移植妊娠率的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛胚胎

荷斯坦牛常规冷冻胚胎（整胚）和取样鉴定后的冷冻雌性胚胎。

胚胎发育阶段：紧缩桑葚胚、早期囊胚、囊胚和扩张囊胚。

胚胎质量：1、2级。

1.1.2 主要药品

CIDR:1.38g孕酮/只；FOLLTROPIN-V:400mg、FSH 10mg/瓶（中科院生物所）；HOLDING（新西兰ICP公司）；PGF2α（齐鲁动物保健品有限公司）；盐酸利多卡因（山东华鲁制药有限公司）。

1.1.3 主要仪器

实体显微镜（OLYMPUS SZ1145），倒置显微镜（OLYMPUS CK40），胚胎分割仪(WETZLAR)，冷冻仪（CL-5500）。

1.1.4 主要耗材和溶液

六孔平皿(PETS公司)，φ35mm平皿、φ60mm平皿(BECTON DICKINSON公司)，显微分割刀、200μL通用吸头（AB Technology, Inc, Pullman WA），胚胎分割液(SPLITTING ，自制)，胚胎保存液（HOLDING，ICP公司)，1.5mol/L乙二醇胚胎冷冻液（EG，ICP公司）。

1.2 方法

1.2.1 供体牛超排处理

选择12月龄以上的荷斯坦育成牛进行超排处理。供体牛体况评分在2.75～3.25之间。在超数排卵处理前加强饲养管理，补充维生素、矿物质和微量元素。供体牛用CIDR-FSH-PG-GnRH法超排处理，用常规非手术法采集胚胎。

1.2.2 胚胎取样方法

将胚胎分割仪与倒置显微镜固定在一起，将显微分割刀固定在显微操作仪的操作手上。在φ60mm平皿中做一个50μL的胚胎分割液滴，每个胚胎在取样前在胚胎分割液中洗5遍，之后放入分割滴中，胚胎被放大100倍进行分割取样。样品取走后，用200μL通用吸头吸取50μL的胚胎保存液，从分割液滴中将取样后的胚胎吸起，放入6孔平皿对应的胚胎保存液滴中，等待冷冻。

1.2.3 胚胎冷冻

常规胚胎（整胚）与取样后的胚胎冷冻方法相同。胚胎在EG冷冻液中平衡5min并装入0.25mL细管后，放于冷冻仪上进行程序化冷冻。冷冻程序：-6℃，平衡5min，植冰，平衡5min，0.5℃/min降温至-35℃投入液氮。

1.2.4 胚胎解冻

将胚胎从液氮中取出直接放入32～35℃水浴中10s，将细管外的水迹拭干，将胚胎直接推入HOLDING液中洗3～4次，采用四段式将胚胎吸入0.25mL塑料细管内移植。

1.2.5 受体牛同期发情处理

采用CIDR+PG法：受体牛发情周期的任一天上午放CIDR，并肌肉注射维生素ADE 10mL/头，记为第0天，第9天上午7:00时注射PGF2α0.6mg/头，并肌肉注射维生素ADE 10mL/头，第12天上午7:00时撤CIDR，第13天观察发情并做好记录，第 21天移植。

1.2.6 胚胎移植及妊娠检查

采用非手术法移植。直肠检查发情后第7～8天的受体，选择黄体发育良好的受体牛进行移植。将胚胎移植到有黄体一侧的子宫角，并保证胚胎发育阶段与受体牛生理阶段的同步性。采取直肠把握法检查移植后60～90d的受体牛妊娠情况。

1.2.7 数据分析

本试验中采用的统计方法全部为χ2检验。

2 结果

2.1 切割取样对胚胎移植妊娠率的影响

表1 胚胎类型对胚胎移植妊娠率的影响

如表1所示，经取样性鉴后的胚胎，冷冻-解冻后的移植妊娠率为48.74%，相比常规冷冻-解冻胚胎移植妊娠率较低，但是差异不显著（P＞0.05），表明取样对胚胎的移植妊娠率无明显影响。

2.2 取样胚胎的质量对移植妊娠率的影响

胚胎质量是影响胚胎移植妊娠率的关键因素。由表2可见，1级胚胎的妊娠率（48.72%），显著高于2级胚胎的妊娠率（38.41%）（P＜0.01）。

表2 胚胎质量对胚胎移植妊娠率的影响

2.3 取样胚胎的发育阶段对移植妊娠率的影响

冲胚时，所获得的胚胎为发情7～8d的胚胎，胚胎的发育阶段为桑葚胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚。本试验中，对取样后并冷冻的桑葚胚、早期囊胚、囊胚和扩张囊胚进行移植妊娠率的比较，结果（表3）发现，扩张囊胚妊娠率最高，为73.33%，与囊胚妊娠率（54.55%）无显著差异（P＞0.05），但显著高于早期囊胚妊娠率（46.56%）和桑葚胚妊娠率（45.77%）（P＜0.05）。囊胚妊娠率（54.55%）相较早期囊胚妊娠率（46.56%）无显著差异（P＞0.05），而相比桑葚胚妊娠率（45.77%）差异显著（P＜0.05）。桑葚胚妊娠率与早期囊胚妊娠率之间无显著差异（P＞0.05）。

表3 胚胎发育阶段对胚胎移植妊娠率的影响

2.4 不同取样细胞数对移植妊娠率的影响

本试验通过对相同质量的胚胎进行不同细胞数的取样来检测其对移植妊娠率的影响。从表4和5中可以发现，无论是1级胚胎还是2级胚胎，当取样细胞数在4～6个时，移植妊娠率最高，分别为49.68%与40.58%，在取8～10个细胞数时，移植妊娠率分别为46.63%和37.00%，其妊娠率相比4～6个细胞数要低。即随着取样数量的增加其移植妊娠率有所下降。但在试验中取样细胞数在1～3个的胚胎并没有获得较高的移植妊娠率，这可能是由于取样切割过程中难度的增加对胚胎造成的隐性损伤程度更大，导致其移植妊娠率降低。对于有散死细胞（SD）的1级胚胎而言，其胚胎质量有所降低，所以移植妊娠率低于其他组；对于有散死细胞（SD）的2级胚胎来说，其移植妊娠率与取样1～3个的相当并高于取样8～10个的，这可能是活细胞数量没有降低又清除了死细胞残留物的结果。但表4、表5各组间移植妊娠率差异均不显著（P＞0.05）。

表4 不同取样数量对胚胎移植妊娠率的影响

表5 不同数量对胚胎移植妊娠率的影响

2.5 取样后胚胎冷冻前在体外放置时间对移植妊娠率的影响

本试验检测了在取样操作中，胚胎在体外放置时间的长短对移植妊娠率的影响。如表6所示，小于2h的妊娠率为47.22%，在2～4h之间的妊娠率为45.91%，大于4h的妊娠率为43.87%（P＞0.05）。尽管各组间没有显著差异，但随着胚胎在体外放置时间的延长，移植妊娠率呈现下降的趋势，所以最好在4h之内完成胚胎冷冻。

表6 胚胎在体外放置不同时间对移植妊娠率的影响

3 讨论

3.1 取样胚胎类型对移植妊娠率的影响

本试验进行了取样性鉴冻胚与常规冻胚移植妊娠率的比较，结果发现，取样性鉴冻胚的移植妊娠率为48.74%，比常规冻胚的移植率49.49%低了0.75个百分点，两者的移植妊娠率无显著差异，这与Lopes所报道的一致[1]。

3.2 取样胚胎质量及取样细胞数对移植妊娠率的影响

有文章报道[2]，胚胎质量是移植妊娠率高低的决定因素。本试验对1级和2级胚胎进行移植，结果如表1所示，1级胚胎妊娠率为48.72%，显著高于2级胚胎妊娠率的38.41%。这一结果与Arreseigor[3]的观点相一致。同时这个结果进一步验证了许瑞锋等[4]的研究结果，即胚胎质量的优、良是影响胚胎在子宫内着床的关键因素。在1级胚胎中取4～6个细胞时，移植妊娠率最高，为49.68%，其他组的结果均低于4～6个细胞取样组。在2级胚胎中同样是取样在4～6个细胞组中的移植妊娠率最高，以上数据说明不同取样细胞数对胚胎移植妊娠率有一定的影响。

3.3 取样胚胎发育阶段对移植妊娠率的影响

超数排卵所获得的体内胚胎的胚龄为6～10日龄，按胚胎发育阶段，将胚胎可分为桑葚胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和孵化胚胎[5]。有文献报道[6，7]，在胚胎移植时囊胚移植妊娠率比桑葚胚高。Shea[8]的研究认为桑葚胚和囊胚的移植妊娠率相似。本试验的研究结果显示，扩张囊胚的移植妊娠率最高，为73.33%，其次是囊胚，为54.55%，早期囊胚和桑葚胚的移植妊娠率较低，分别为46.56%和45.77%，与Hasler的研究结果一致。

3.4 取样胚胎冷冻前在体外放置时间对移植妊娠率的影响

为了获得理想性别的胚胎，其中一种途径是在胚胎移植前对胚胎切割取样并鉴定雌雄，因此需要在体外放置一定时间再进行冷冻，而胚胎长时间在体外存放可能会对其移植妊娠率有一定的影响。本试验对取样冻胚进行移植得出的结果为：在体外放置时间≤2h的胚胎移植妊娠率为47.22%，在体外放置2～4h的胚胎移植妊娠率为45.91%，在体外放置4h以上的胚胎移植妊娠率为43.87%，这表明随着胚胎在体外存放时间的延长胚胎移植妊娠率有下降的趋势，这一结果与Pettit等[9]和Wright[10]的研究结果一致。在实际操作中，应尽可能将胚胎在体外放置时间控制在4h以内。