鳖甲生血丸对骨髓纤维化大鼠作用机制的实验研究※

吴维海 袁 炜 李建英 张振会 白艳辉

(河北省石家庄平安医院血液科，河北 石家庄 050021)

骨髓纤维化是骨髓增殖性肿瘤的一种，主要是由于骨髓中胶原组织沉积、纤维组织增生，进而导致骨髓正常的造血功能受到影响所引起的一种疾病[1]。现代医学研究认为，骨髓纤维化与肝纤维化的发病机制具有相似性，骨髓纤维化、肝纤维化以及肺纤维可以被认为是同一病理类型在不同靶器官的表现，50%～70%的骨髓纤维化患者合并肝大，10%～20%合并肝硬化，病理均提示肝纤维化[2-3]。目前，临床上对骨髓纤维化的发病机制进行了深入研究，多种细胞生长因子被认为在骨髓纤维化过程中发挥了重大作用，其中以血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β1)及血管内皮生长因子(VEGF)的研究最为广泛[4-5]。鳖甲生血丸是我们临床治疗骨髓纤维化的经验方，先前研究表明其对骨髓纤维化具有确切疗效[6]。为进一步探讨鳖甲生血丸治疗骨髓纤维化的作用机制，我们通过建立肝纤维化大鼠模型(目前建立骨髓纤维化动物模型的成功率较低，尚不具备实验条件)，观察鳖甲生血丸对大鼠肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量变化，肝细胞损伤程度分级和肝维纤化程度分级变化，以及血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平的影响，探讨其治疗骨髓纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠72只，体质量180～240 g，周龄6～7周，饲养环境温度20～24 ℃，相对湿度40%～60%，实验期间自由饮食、饮水，购于河北省实验动物中心，动物合格证号：1119069。

1.2 主要药物及试剂 鳖甲生血丸(主要由醋鳖甲、炒桃仁、水蛭、三棱、熟大黄、熟地黄、紫河车、三七及甘草组成，由河北省石家庄平安医院制剂室制成丸剂)研磨后用蒸馏水调配成浓度分别为0.07、0.14、0.28 g/mL的药液备用；肝复康丸(陕西华西制药股份有限公司，国药准字Z20003377)。四氯化碳(天津市河东区红岩试剂厂)；PDGF、TGF-β1及VEGF的酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)。

1.3 主要仪器 安图PHOMO酶标仪(安图实验仪器有限公司)；恒温水浴箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司)；奥林巴斯CX31生物显微镜(日本奥林巴斯有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 将72只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、鳖甲生血丸低剂量组、鳖甲生血丸中剂量组、鳖甲生血丸高剂量组及肝复康丸组，每组12只。除正常对照组外，其余5组均进行肝纤维化模型制备，即实验第1 d予100%四氯化碳0.5 mL/100 g于大鼠后腿皮下注射，以后每周一和周四按0.3 mL/100 g注射40%四氯化碳豆油溶液，共连续注射9周[7]。

1.4.2 给药方法 从造模开始的第5周，正常对照组及模型对照组予蒸馏水1 mL/100 g灌胃，每日1次。鳖甲生血丸低、中、高剂量组分别予鳖甲生血丸1 mL/100 g(生药含量分别为0.07、0.14、0.28 g/mL)的药液灌胃，每日1次。肝复康丸组予肝复康丸0.42 g/100 g灌胃，每日1次。各组大鼠均连续灌胃5周。

1.4.3 标本采集 各组大鼠在末次灌胃前均禁食12 h，末次灌胃2 h后给予3%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉后，脱颈处死。抽取颈总动脉血1 mL，分离血清待检，并切除肝脏组织送检病理。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 一般情况 观察各组大鼠实验期间的一般情况，包括进食、饮水、活动、体质量增长及死亡情况。

1.5.2 肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量检测 各组大鼠均取适量肝脏组织，参照文献[8]中的检测方法对大鼠肝脏组织中Hyp含量进行测定，进而对肝纤维化造模情况进行评估。

1.5.3 血清PDGF、TGF-β1及VEGF检测 血清PDGF、TGF-β1及VEGF的检测均采用ELISA法[9]，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.4 组织病理学观察 将剩余肝脏组织用10%甲醛溶液固定48 h，然后常规进行石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红(HE)法染色，在生物显微镜下观察肝小叶、肝细胞变化情况，以及纤维组织增生情况。肝细胞损伤程度的分级标准：①“-”，正常肝组织；②“+”，肝细胞变性范围没有超过肝小叶半径的1/2，以水变性为主，肝细胞呈点状或小灶状坏死，汇管区炎症细胞浸润；③“++”，肝细胞变性范围超过了肝小叶半径的1/2，但没有超过2/3，以气球样变性为主，较多肝细胞呈碎片状坏死，汇管区大量炎症细胞浸润；④“+++”，肝细胞变性坏死范围超过肝小叶半径的2/3，以碎片状、桥接状坏死为主[10]。肝纤维化程度采用Metavir评分系统的分级标准：①F0，无纤维化；②F1，汇管区纤维性扩大，但没有纤维间隔形成；③F2，汇管区纤维性扩大，少数纤维间隔形成；④F3，多数纤维间隔形成，但没有硬化结节；⑤F4，肝硬化[11]。

2 结 果

2.1 各大鼠一般状况 正常对照组12只大鼠进食、饮水、活动及体质量增长情况均无异常，均存活至实验结束；模型对照组大鼠死亡5只，其余7只大鼠进食、饮水、活动及体质量增长情况较正常对照组大鼠均减少；鳖甲生血丸低、中、高剂量组大鼠分别有3、2、2只死亡，肝复康组大鼠有3只死亡，其余存活至实验结束的大鼠进食、饮水、活动及体质量增长情况较模型对照组均有好转。

2.2 各组大鼠灌胃5周后肝组织Hyp含量比较 见表1。

由表1可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠灌胃5周后肝组织Hyp含量升高，比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示肝纤维化模型造模成功。与模型对照组比较，鳖甲生血丸中、高剂量组及肝复康丸组灌胃5周后肝组织Hyp含量均下降，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但各组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。鳖甲生血丸低剂量组大鼠灌胃5周后肝组织Hyp含量较模型对照组虽然也有下降趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组 别nHyp正常对照组120.117±0.005模型对照组70.414±0.111∗鳖甲生血丸低剂量组90.326±0.101鳖甲生血丸中剂量组100.268±0.106△鳖甲生血丸高剂量组100.246±0.083△肝复康丸组90.259±0.095△

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

2.3 各组大鼠灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平情况比较 见表2。

由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均升高，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康丸组大鼠灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均下降，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但各组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

组 别nPDGF(ng/L)TGF-β1(ng/mL)VEGF(μg/L)正常对照组12808.92±161.18168.72±31.41120.52±28.54模型对照组71 521.46±194.29∗312.83±37.57∗241.14±53.15∗鳖甲生血丸低剂量组9935.51±153.90△206.13±29.50△165.71±23.73△鳖甲生血丸中剂量组10836.72±114.81△218.52±49.62△176.26±27.65△鳖甲生血丸高剂量组10815.68±134.05△202.84±36.51△179.95±22.57△肝复康丸组9864.61±68.89△228.16±37.27△173.84±23.80△

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

2.4 各组大鼠灌胃5周后肝细胞损伤分级比较 见表3。

表3 各组大鼠灌胃5周后肝细胞损伤分级比较 只

表3数据经Ridit分析显示，模型对照组灌胃5周后肝细胞损伤分级情况与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，模型对照组肝细胞损伤程度重于正常对照组。鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康丸组大鼠灌胃5周后肝细胞损伤分级情况与模型对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，各组肝细胞损伤程度均轻于模型对照组，但各组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组大鼠灌胃5周后肝纤维化分级比较 见表4。

表4数据经Ridit分析显示，模型对照组灌胃5周后肝纤维化分级情况与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，模型对照组肝纤维化程度重于正常对照组。鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康丸组大鼠灌胃5周后肝纤维化分级情况与模型对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，各组肝纤维化程度均轻于模型对照组，且鳖甲生血丸中、高剂量组及肝复康丸组与鳖甲生血丸低剂量组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，肝纤维化程度均轻于鳖甲生血丸低剂量组，但鳖甲生血丸中、高剂量组及肝复康丸组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠灌胃5周后肝纤维化分级比较 只

2.6 各组大鼠肝组织病理学观察情况 正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝组织无纤维组织增生；模型对照组肝小叶结构被破坏，甚至消失，肝细胞索排列不整齐，肝细胞肿胀、变性、炎性细胞浸润，甚至伴不同程度肝细胞坏死，肝脏纤维组织明显增生，其中5只大鼠出现肝硬化，2只大鼠多数纤维间隔形成，但没有硬化结节；与模型对照组对比，鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康组大鼠的肝小叶结构被破坏程度明显减轻，肝细胞肿胀、变性、坏死程度明显减轻，但鳖甲生血丸低剂量组仍有2只大鼠出现肝硬化，5只大鼠表现为多数纤维间隔形成，但没有硬化结节，而鳖甲生血丸中、高剂量组及肝复康组大鼠主要表现为汇管区纤维性扩大，但没有纤维间隔形成或少数纤维间隔形成。见插页1，图1。

3 讨 论

骨髓纤维化是由于促进纤维化的细胞生长因子过度释放，刺激骨髓间质成纤维细胞异常激活，导致纤维化的过程，因此亦被称为骨髓间质纤维化[12]。骨髓中异常克隆性增殖的造血干细胞逐渐取代了正常的造血组织，引起一系或者多系的造血细胞增多，尤其是功能异常的巨核细胞产生的细胞因子风暴，大量的PDGF、TGF-β1、成纤维细胞生长因子(FGF)等细胞因子引起反应性的、多克隆的纤维组织异常增生，进而使胶原形成过多，导致骨髓纤维化[13-15]。PDGF是由单核-巨噬细胞产生的，是一种重要的促细胞分裂剂，尤其对纤维母细胞有很强的促分裂作用，能分泌胶原蛋白，促进Ⅲ型胶原合成。研究表明，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)亚单位在骨髓实质中的表达具有差异，PDGFRα在正常骨髓的巨核细胞、内皮细胞中有表达，而PDGFRβ基本很少表达，但在骨髓纤维化患者中，PDGFRβ却强烈表达，PDGFRα只有少量的表达，并认为PDGFRβ表达随着骨髓纤维化程度的增加而相对增加,其表达发生早于成纤维细胞和胶原纤维的形成，在骨髓纤维化前期的诊断中具有重要意义，PDGF可能在骨髓纤维化的发病机制中发挥重要作用[16-17]。TGF-β1对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用，影响细胞外基质组成和下游相关酶的合成，参与了所有器官纤维化的过程，TGF-β1浓度与纤维化严重程度有密切关系。研究表明，在酸性环境中TGF-β1被蛋白酶激活后可以促进胶原蛋白、纤维连接蛋白及糖蛋白的合成，减少胶原酶样蛋白酶合成，提高蛋白酶抑制物表达，抑制多种抗氧化酶表达，导致氧活性物质生成增加、调节紊乱，促进纤维化的发生[18-19]。肌成纤维细胞是组织纤维化过程中产生胶原的主要细胞类型，TGF-β1还可通过Smad信号通路促进巨噬细胞转变成肌成纤维细胞，诱导Ⅰ型和Ⅲ型胶原转录，参与肝纤维化的发生，是促进肝星状细胞活化和细胞外基质增殖的主要细胞生长因子，在肝纤维化的形成中发挥了重要的作用[20-21]。内皮细胞和成纤维细胞是造血微环境的重要组成部分，这些细胞的生长和功能受多种细胞因子的控制。VEGF是直接作用于血管内皮细胞的生长因子,可特异性促进内皮细胞增殖、分裂和迁移,增加血管通透性,促进血管生成。有研究发现，骨髓纤维化患者骨髓组织中的微血管密度明显增加，可能与骨髓纤维组织增生有关[22]。另有研究认为，VEGF表达水平增高可引起TGF-β1mRNA的表达增强，使得TGF-β1分泌增多，活性增强，从而促进纤维化[23]。

中医学中并无骨髓纤维化的病名，但根据其贫血、脾大、或伴肝大、骨髓纤维组织增生等临床特征，可将其归属于髓毒微癥病范畴，血瘀是其主要病机[24]。隋·巢元方《诸病源候论》指出：“瘀血在内,则时时体热而面黄,瘀久不消,则变成积聚癥瘕也。”东汉·张仲景在《金匮要略》言:“五劳虚极羸瘦,腹满不能饮食。食伤、忧伤、饮伤、房室伤、饥伤、劳伤,经络荣卫气伤,内有干血,肌肤甲错,两目黯黑。”明·王肯堂《证治准绳》言:“瘀血成块，坚而不移，名曰血癥。”清·王清任在《医林改错》中提到：“肠胃之外,无论何处,皆有气血。气有气管,血有血管。气无形不能结块,结块者,必有形之血也,血受寒,则凝结成块;血受热,则煎熬成块。”中医学认为，肺朝百脉，心主血脉，肝藏血，脾胃为气血生化之源，诸脏失常，皆可致瘀血内阻。我们结合古典医籍记载及现代医学研究成果，认为骨髓纤维化主要是由于先天禀赋不足，后天外感邪毒，或劳倦过度，或七情内伤，或饮食失常，或药物失治误治，引起脏腑阴阳失调，气血化生不足，瘀血不去，新血不生，阻滞经络而发病，脾大即血瘀，贫血即血虚，故为虚实夹杂证。根据“虚则补之，实则泻之”的治疗原则，应以祛瘀生新为治则。鳖甲生血丸是我们根据多年临床经验总结出来的经验方，先前的研究表明其对骨髓纤维化治疗的总有效率为71.67%，治疗后患者临床症状明显改善，骨髓活检显示纤维化程度均有不同程度的减轻[6]。方中鳖甲滋阴潜阳，软坚散结；熟大黄逐瘀通经，泻热解毒，与鳖甲配伍可增强其活血化瘀功效；炒桃仁活血化瘀；三棱、水蛭，破血行气，逐瘀消积；熟地黄、紫河车补气养血，并防大黄、三棱过度攻伐之弊；三七止血补血而不留瘀；甘草益气解毒，调和诸药。诸药合用，共奏活血化瘀、软坚散结、祛瘀生新的功效。

Hyp是亚氨基酸之一，人体蛋白质中以胶原蛋白Hyp水平含量最多，约占胶原蛋白氨基酸总量的13%，除弹性蛋白含极少量Hyp外，其他均不含Hyp，通过测定肝脏组织的Hyp含量，可反映肝脏纤维化程度。肝复康丸为临床治疗急慢性肝炎、肝硬化、肝功能不良等疾病的常用药物，具有收敛、益气、解毒的功效，在一定程度上可以修复受损的肝细胞，改善肝功能，对肝纤维化的治疗具有确切疗效[25]，因此我们选用了肝复康丸作为对照观察治疗。本实验研究结果显示，灌胃5周后鳖甲生血丸中、高剂量组及肝复康丸组大鼠肝组织Hyp含量均低于模型对照组(P<0.05)，鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康丸组大鼠血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均低于模型对照组(P<0.05)，鳖甲生血丸低、中、高剂量组及肝复康丸组大鼠肝细胞损伤分级情况及肝纤维化分级情况均轻于模型对照组(P<0.05)，且鳖甲生血丸中、高剂量组与肝复康丸组大鼠各指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。提示鳖甲生血丸可明显抑制纤维组织增生，减少组织内胶原的形成和沉积，且中、高剂量组效果更好，其治疗骨髓纤维化的作用机制可能与降低Hyp、TGF-β1、PDGF及VEGF水平有关。