补肾疏肝汤对慢性疲劳综合征大鼠模型抗疲劳作用机制的实验研究※

牛占忠 刘丁丁 岳 雁 张喜平

(沧州医学高等专科学校针推教研室，河北 沧州 061001)

慢性疲劳综合征是一组症候群，以慢性疲劳为主要症状，常伴焦虑、抑郁、失眠、无固定部位的疼痛、不适、性功能低下、免疫力低下引起的类似感冒症状等表现。目前本病发病率极高，尤其是在大中城市，确切发病病因不明，严重影响人们的身体健康。有资料表明，慢性疲劳综合征的发生与下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴调节过程出现异常相关，还与5-羟色胺(5-HT)功能低下有关[1-3]。还有研究表明，慢性疲劳综合征的发生与自由基的代谢关系密切[4-5]。我们临床应用补肾疏肝汤治疗慢性疲劳综合征取得了良好效果[6-7]。本实验通过研究补肾疏肝汤对慢性疲劳综合征大鼠模型抗疲劳的作用机制，为补肾疏肝汤治疗慢性疲劳综合征提供确切的证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性健康SD大鼠50只，清洁级，体质量230～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)201520001。饲养动物环境：实验室清洁饲养，温度21～26 ℃，湿度50%左右，噪声<60 dB，照明12 h明、12 h暗。

1.1.2 实验药物 补肾疏肝汤药物组成：熟地黄20 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，生地黄20 g，玄参15 g，麦冬15 g，当归12 g，川芎10 g，柴胡10 g，枳壳10 g，黄芩12 g，黄连6 g，甘草6 g。按原方比例加重蒸水浸泡1 h后煎煮，武火煎开，文火继续煎煮20 min，然后滤取药液，药渣再加重蒸水煎煮20 min后滤取药液。2次所取药液混合，浓缩至含生药2 g/mL，灭菌密封备用。

1.1.3 实验试剂 丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号:2015926)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号：20151012)、5-HT免疫组化试剂盒(批号：2015612)，均由南京建成生物工程研究所提供。大鼠过氧化物酶体增殖激活物受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(批号:20150413)、大鼠细胞色素C氧化酶(COX)ELISA试剂盒(批号:20150721)，均由苏州卡尔文生物科技有限公司提供。

1.1.4 实验仪器 大鼠实验泳缸(自制)、剥夺睡眠所用加铁丝网的塑料盆(自制)、电子天平(上海英衡电子秤有限公司)、秒表(武汉双龙旭光体育器材有限公司)、超声波细胞粉碎仪(宁波唯诚超声波设备科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将50只SD大鼠按照随机数字表法分为5组，即空白组、模型组及补肾疏肝汤低、中、高剂量组，各组均10只。

1.2.2 模型制备 采用文献[8]中力竭游泳加剥夺睡眠20 h方法制备慢性疲劳综合征模型。空白组大鼠不参加模型制备。每日9:00，让除空白组外其他各组大鼠在自制的实验泳缸中进行1次力竭游泳。泳缸长100 cm、宽40 cm、高60 cm。其中储水深度50 cm，水温(25±1) ℃。进行实验前，先记录大鼠体质量，并在大鼠尾巴根部绑缚相当于其体质量5%的负重铅皮，然后将大鼠放入泳缸中进行负重游泳并开始计时。当大鼠达到力竭状态(即大鼠游泳姿态失常，出现慌张表现，肢体动作失调，在水中活动范围减小，经常打圈，不能在大范围内来回游动，甚至仅能在一个角落勉强保持鼻尖露出水面。或大鼠完全沉没于水中，不能自行浮出达10 s),将其捞出，记录游泳持续时间，即力竭游泳时间。并用毛巾将其身体擦干，用电热风机吹干皮毛，将其放入鼠笼中休息，予正常饮食及水，保持环境温度在21～26 ℃。当日13：00给予大鼠剥夺睡眠处理。将大鼠放入盛水的塑料盆中，水深1.5 cm，使大鼠不能安然入睡，然后用铁丝网封固，防止大鼠逃脱。同时供应大鼠正常食物和水，持续至第2 d 9：00，进行下一周期的力竭游泳加剥夺睡眠20 h。每日1次，连续14 d。

1.2.3 给药方法 在造模同时，空白组、模型组均予0.9%氯化钠注射液40 mL/(kg·d)灌胃；补肾疏肝汤低、中、高剂量组分别予补肾疏肝汤40 mL/(kg·d)灌胃，其含生药量分别为17.28、34.56、69.12 g/(kg·d)，分别相当于人体用量1、2、4倍。均连续灌胃14 d。

1.3 观察指标及方法 ①比较各组大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳时间。②在大鼠第14 d末次力竭游泳后禁食24 h，0.03%水合氯醛腹腔麻醉后腹主动脉取血，应用比色法检测血清MDA、SOD水平。③分离出大鼠全脑，去除两侧菱形突起，切取中央部分的下丘脑标本，用免疫组化法检测5-HT含量。④快速取出各组大鼠后肢骨骼肌组织1块，称取1 g放入0.9%氯化钠注射液中漂洗去血液，用滤纸拭干后，将组织加入适量0.9%氯化钠注射液捣碎，3 000 r/min离心10 min，取上清液制成骨骼肌组织匀浆，分装标号置于-20 ℃冰柜中保存。由专业人员按PGC-1α ELISA试剂盒说明书中的步骤检测大鼠骨骼肌中PGC-1α含量。将取好的骨骼肌组织剪碎，移至预冷的玻璃匀浆器中，按照5 mL/g用量加入分离介质[pH=7.4，蔗糖0.25 mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)0.005 mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.001 mol/L]，上下匀浆30次，将匀浆液低温1 200 r/min离心10 min，取其上清液；再用低温超速12 000 r/min离心20 min，弃其上清液，其沉淀部分即为线粒体。加入2 mL分离介质，制成线粒体匀浆液，再用超声波细胞粉碎仪打碎线粒体膜结构，制成线粒体悬浮液，分装标号置于-20 ℃冰柜中保存。整个过程在0～4 ℃进行。按COX ELISA检测试剂盒说明书中的步骤检测大鼠骨骼肌中COX含量。

2 结 果

2.1 各组大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳时间比较 见表1。

组 别n第1 d首次力竭游泳时间第14 d末次力竭游泳时间空白组10__模型组10741.0±143.5496.0±94.6补肾疏肝汤低剂量组10729.0±197.4643.0±112.9∗△#补肾疏肝汤中剂量组10746.0±157.8907.0±172.8∗#补肾疏肝汤高剂量组10735.0±178.3719.0±101.2∗△

与模型组比较，*P<0.05；与补肾疏肝汤中剂量组比较，△P<0.05；与本组第1 d首次力竭游泳时间比较，#P<0.05

由表1可见，补肾疏肝汤低、中、高剂量组大鼠第14 d末次力竭游泳时间均较模型组延长(P<0.05)，且补肾疏肝汤中剂量组大鼠第14 d末次力竭游泳时间最长(P<0.05)。补肾疏肝汤低剂量组第14 d末次力竭游泳时间较第1 d首次力竭游泳时间缩短(P<0.05)；补肾疏肝汤中剂量组第14 d末次力竭游泳时间较第1 d首次力竭游泳时间延长(P<0.05)。

2.2 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较 见表2。

组 别nSOD(U/mL)MDA(nmol/mL)空白组10142.52±14.904.39±0.51模型组10114.84±8.32∗7.79±0.80∗补肾疏肝汤低剂量组10136.44±18.53△#4.54±0.66△#补肾疏肝汤中剂量组10172.97±16.38△3.46±0.56△补肾疏肝汤高剂量组10163.28±13.79△#5.98±0.61#

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与补肾疏肝汤中剂量组比较，#P<0.05

由表2可见，模型组大鼠血清SOD水平低于空白组(P<0.05)，MDA水平高于空白组(P<0.05)。补肾疏肝汤低、中、高剂量组大鼠血清SOD水平均高于模型组(P<0.05)，补肾疏肝汤低、中剂量组大鼠MDA水平低于模型组(P<0.05)。补肾疏肝汤中剂量组大鼠血清SOD水平高于补肾疏肝汤低、高剂量组(P<0.05)，MDA水平低于补肾疏肝汤低、高剂量组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠下丘脑5-HT含量比较 见表3。

组 别n5-HT(pg/mL)空白组1012.82±1.73模型组109.18±1.47∗补肾疏肝汤低剂量组109.44±1.53补肾疏肝汤中剂量组1011.97±2.03△补肾疏肝汤高剂量组1010.41±1.83△#

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与补肾疏肝汤中剂量组比较，#P<0.05

由表3可见，模型组大鼠下丘脑5-HT含量低于空白组(P<0.05)。补肾疏肝汤中、高剂量组大鼠下丘脑5-HT含量均高于模型组(P<0.05)，且补肾疏肝汤中剂量组高于补肾疏肝汤高剂量组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量比较 见表4。

由表4可见，模型组大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均低于空白组(P<0.05)。补肾疏肝汤低、中、高剂量组大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型组(P<0.05)，且补肾疏肝汤中剂量组大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量最高(P<0.05)。

组 别nPGC-1α(nmol/L)COX(nmol/mg)空白组10231.28±19.68120.89±9.86模型组10154.25±20.36∗78.12±10.08∗补肾疏肝汤低剂量组10179.22±18.75△#108.54±8.93△#补肾疏肝汤中剂量组10208.32±16.39△128.36±14.43△补肾疏肝汤高剂量组10192.45±17.96△#124.66±11.65△#

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与补肾疏肝汤中剂量组比较，#P<0.05

3 讨 论

中医学认为，肾中元气运行全身各处，以维持全身各脏腑、组织、器官的生理功能。元气充足则全身各脏腑、组织、器官功能正常；元气不足，则各脏腑、组织、器官功能低下。同时，肾中元气通过肝的疏泄作用运行全身各处，肝的疏泄功能不正常，元气不能通过经络流通到全身各处，各脏腑、组织、器官不能得到元气充养而功能低下。这时，人就会出现慢性疲劳综合征所表现出的症状，如疲劳、乏力、气短、腰痠、烦躁、失眠、抑郁、焦虑、性功能低下等症状。故肾虚和肝郁是慢性疲劳综合征发病的重要病机。补肾疏肝汤正是依据这一病机制定的方剂。方中熟地黄、淫羊藿、枸杞子、生地黄、玄参、麦冬滋阴壮阳，补助肾气；当归、川芎养血行血；柴胡、枳壳疏肝理气；黄芩、黄连清肝郁之火。诸药合用，起到补肾、疏肝的功效。

目前，慢性疲劳综合征的发生机制尚不确切，认为氧自由基和脂质过氧化过程与疲劳的产生有着密切关系。氧自由基在脂质过氧化过程中起决定性作用，促进MDA生成。体内产生的MDA可使蛋白质性质发生变化，因为体内的酶由蛋白质构成，所以MDA可使一些酶发生变性，失去应有的活性。大量氧自由基对细胞内线粒体及其他细胞器造成损伤，从而促进细胞衰老、凋亡[9-10]，使机体组织器官功能低下，产生疲劳。所以MDA可作为衡量机体细胞功能损伤的一个指标，间接反映机体疲劳状态。同时，氧自由基的生成过程也受到一定限制。氧自由基的产生可被机体内某些抗氧化剂或抗氧化酶阻止，抗氧化剂和抗氧化酶间接起到了保护细胞免受损伤的作用。比如机体细胞中的SOD可催化超氧阴离子歧化为过氧化氢(H2O2)和氧(O2)，进而清除氧自由基，使机体细胞免受氧自由基的损伤。当机体内抗氧化剂和抗氧化酶不足时，细胞损伤加重。当抗氧化剂和抗氧化酶被消耗完后，细胞线粒体受到损伤，出现功能障碍，影响细胞代谢，导致细胞凋亡，使机体组织损伤，功能低下。本研究结果显示，补肾疏肝汤可使慢性疲劳综合征大鼠血清SOD升高，MDA下降。说明补肾疏肝汤通过增强机体自身抗氧化酶活性，进而提高自身抗氧化能力，提高清除体内氧自由基，减少氧自由基对机体的损伤，而起到消除疲劳的作用。

慢性疲劳综合征的产生与内分泌系统关系密切，内分泌紊乱是慢性疲劳综合征形成的基础之一。机体内分泌系统由下丘脑控制。HPA轴是内分泌系统的通路，由下丘脑控制，其功能紊乱可导致疲劳产生。常见的单胺类递质如多巴胺、5-HT等对HPA轴的调控有重要作用，与人体的许多生理活动关系密切。当下丘脑5-HT含量充足，机体处于兴奋状态时，人表现为情绪高涨，思维敏捷，动作精准、有力，意志力坚定，饮食、睡眠正常。当下丘脑5-HT含量不足时，人体处于抑制状态，表现为疲劳[11-12]。所以，下丘脑5-HT含量可反映机体慢性疲劳状态。本研究结果显示，补肾疏肝汤中、高剂量组大鼠下丘脑5-HT水平均高于模型组(P<0.05)，提示补肾疏肝汤可能通过调节5-HT回归正常水平，进而调节HPA轴来缓解大鼠的慢性疲劳。

有研究表明，PGC-1α是一个转录激活因子，它在机体组织中分布具有特异性，在需要提供比较多能量的组织中分布较多，而在需要能量较少的组织中分布较少[13]。在机体需要提供比较多能量的组织如心肌、骨骼肌中分布最多。PGC-1α参与机体内很多代谢过程。线粒体是细胞生产能量的场所，在线粒体中，细胞通过氧化磷酸过程生成大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，ATP是机体生命活动的基本物质，为机体各种生理活动提供能量。PGC-1α能调控线粒体在体内的合成。在机体需要大量能量时，PGC-1α可调控细胞产生大量线粒体，并且可诱导线粒体产生大量ATP[14]。此外，PGC-1α蛋白可使机体增加Ⅰ型肌纤维的比例。Ⅰ型肌纤维含有更多的线粒体，在机体耗氧量增多时可提供更多能量。所以，机体中Ⅰ型肌纤维的含量比例高是抗疲劳能力高的标志。骨骼肌中PGC-1α的含量间接反映了机体对抗疲劳的能力，因此骨骼肌中PGC-1α含量可作为衡量机体抗疲劳的指标。COX是细胞器线粒体上的一种氧化还原酶，也是线粒体上具有标志意义的酶，线粒体的氧化呼吸依靠它来完成。COX可催化还原型细胞色素C氧化，通过此反应实现细胞的氧化磷酸化过程，产生能为细胞、组织提供能量的ATP[15]。所以，线粒体中COX活性与线粒体产生的能量关系密切，机体骨骼肌中COX含量的增高提示机体内能量产生增多，也反映了机体抗疲劳能力增强。本研究结果表明，补肾疏肝汤低、中、高剂量组大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型组(P<0.05)，说明补肾疏肝汤低、中、高剂量组均可提高机体骨骼肌中PGC-1α、COX的含量，具有抗疲劳作用。

在慢性疲劳的动物实验中，体能测定是判断动物抗疲劳的指标之一，而力竭游泳时间是反映体能的直观指标。本研究结果表明，补肾疏肝汤低、中、高剂量组大鼠第14 d末次力竭游泳时间均较模型组延长(P<0.05)，说明补肾疏肝汤可以增加疲劳大鼠力竭游泳时间，增强大鼠体力，具有抗疲劳作用，而补肾疏肝汤中剂量组作用更明显(P<0.05)。

综上所述，补肾疏肝汤对慢性疲劳综合征大鼠模型具有抗疲劳作用，效果确切,根据实验数据观察，补肾疏肝汤中剂量组更值得临床研究。