参苓白术散对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠Kupffer细胞mTORC1/STAT3信号通路的影响※

黄裕华 徐拥建 冯高飞 黄柏强 杨 英 邓远军

[北京中医药大学深圳医院(龙岗)肝病科，广东 深圳 518172]

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损伤致病因素，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪性样变为主要特征的一组临床病理综合征。现代医学认为，NAFLD是一种导致机体能量稳态失衡的遗传、环境、代谢应激相关性肝病，是代谢综合征在肝脏的表现，包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及由其引起的肝纤维化、肝硬化。NAFLD发病机制复杂，至今未完全阐明，据相关研究报道，可能与脂质代谢障碍、胰岛素抵抗(IR)、摄入过量果糖、脂肪组织功能紊乱，肠道菌群失调导致炎症、氧化应激、内质网应激有关[1-3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)属于丝/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内的中心信号调控分子，其对细胞生长周期进程、蛋白质合成及降解、膜蛋白的转运、蛋白激酶信号转导等起到至关重要的作用。细胞转导子和转录活化子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)作为细胞转导子和转录活化子家族(STATs)的一员，与肝脏关系最密切，在被激活后可转位进入细胞核内，并与脱氧核糖核酸(DNA)结合，启动下游基因表达，促进脂质蓄积，并产生局灶性炎性微环境，维持细胞功能，调控细胞生长[4]。本实验通过观察参苓白术散对NAFLD大鼠肝Kupffer细胞mTOR复合物1(mTORC1)/STAT3信号通路相关基因及蛋白表达的影响，探讨其对NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠80只，8周龄，体质量(200±20) g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号：SCXK(鲁)20140007。大鼠饲养于SPF级动物实验室内，温度为22～26 ℃，湿度为45%～55%，明暗各12 h，自由进水进食。

1.1.2 实验药物 参苓白术散[5]药物组成：人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，砂仁6 g，山药15 g，白扁豆12 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，莲子9 g，炙甘草9 g。方中药材均为华润三九医药股份有限公司生产的免煎单味中药配方颗粒剂。按上述中药配方颗粒剂相当于药材饮片的剂量，换算成实验室所需饮片剂量，溶于水，调匀制成混悬液备用。高脂饲料由基础饲料(88.0%)、猪油(10.0%)、胆固醇(1.5%)、Ⅲ号胆盐(0.5%)组成。

1.1.3 实验仪器及试剂 全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；Epoch酶标仪(美国Bio-Tek公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；微量核酸分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；双通道通用型注射泵(KDS200型，美国KD Scientific公司)；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time-PCR)仪(美国BIO-RAD公司)；TRizol裂解液、Quant cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；mTORC1-抗体(mTORC1-Antibody)、STAT3-抗体(STAT3-Antibody)(美国Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(北京雷根生物技术有限公司)；兔抗大鼠溶菌酶抗体(Anti-Lysozyme)(上海依科赛生物制品有限公司)；过氧化物酶(HRP)羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(广州雅怡生物科技有限公司)；Ⅳ型胶原酶(美国GIBCO公司)；大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-5、IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；3%戊巴比妥钠溶液、10%多聚甲醛溶液(上海铭博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将80只SD大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为4组，空白组、模型组及参苓白术散低、高剂量组，每组20只。

1.2.2 模型制备 空白组大鼠予基础饲料喂养，其余3组均予高脂饲料喂养制备NAFLD模型[6]。同时参苓白术散低、高剂量组均按10 mL/kg给予相应剂量参苓白术散灌胃，每日1次，连续8周。每只大鼠的具体给药剂量按动物体型系数换算法折算[7]，参苓白术散低剂量组为人临床等效剂量(含生药量1.0 g/mL)，参苓白术散高剂量组为人临床等效剂量的3倍用量(含生药量3.0 g/mL)。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 一般情况 实验期间观察各组大鼠体态毛色、行为能力、食欲、大小便及对外界刺激的反应情况。

1.3.2 肝组织病理学观察 在第8周末次给药后，经禁食不禁水12 h后，各组随机选取10只大鼠，予3%戊巴比妥钠溶液1 mL/kg腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血后处死，取大鼠肝组织保存备用。在肝右叶相同区域取1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm的小块组织，为避免脂滴降解，务必于当日行冰冻切片，厚约6 μm，油红O脂肪染色法后，400倍光镜下观察肝组织内脂滴分布及病理组织学变化。另取若干小块肝组织以10%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，做4 μm切片，行苏木素—伊红(HE)染色，中性树脂封固，200倍光镜下观察大鼠肝组织脂肪变性程度。

1.3.3 Kupffer细胞分离与鉴定 余下每组10只大鼠用以提取原代肝Kupffer细胞[6，8-10]，Kupffer细胞纯度达90%以上。

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1.3.4 血脂指标及Kupffer细胞炎症因子检测 经腹主动脉取血，存于无抗凝添加剂的采血管内，采用全自动生化分析仪检测血脂指标总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。采用Epoch酶标仪检测Kupffer细胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6含量，严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.5 Real time-PCR检测 Kupffer细胞mTORC1、STAT3 mRNA表达取培养的贴壁Kupffer细胞，经4 ℃，12 000 r/min，离心8 min，弃上清液，加入TRizol裂解液1 mL裂解Kupffer细胞，提取总RNA，用微量核酸分光光度计检测总RNA浓度，按照Quant cDNA第一链合成试剂盒说明，逆转录为cDNA。取反转录产物进行Real time-PCR反应。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计及合成，选用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因。mTORC1：上游引物：5'-CAGAGGGCAGCAACAGTGAAAG-3'，下游引物：5'-GACAAGGAGATAGAACGGAAGAAGC-3'，片段长度：134 bp；STAT3：上游引物：5'-ACCAGCAGTAT-AGCCGCTTC-3'，下游引物：5'-GCCACAATC-CGGGCAATCT-3'，片段长度：97 bp；GAPDH：上游引物：5'-GATCCCGCTAACATCAAATG-3'，下游引物：5-'GAGGGAGTTGTCATATTTCTC-3'，片段长度：96 bp。按照说明书在冰台上配置20 μL反应液，反应条件为95 ℃持续30 s预变性；95 ℃持续10 s变性；mTORC1、STAT3、GAPDH 60 ℃退火30 s；60 ℃延伸40 s，扩增39个循环；再于70～90 ℃，持续5 s，分析溶解曲线。用Opticon Monitor 3.1软件整理和分析。设定空白组基因表达水平为1。公式：2-△△Ct=实验项目的基因表达相对于空白组的变化倍数。△△Ct=实验组(Ct目的基因-Ct内参基因)-空白组(Ct目的基因-Ct内参基因)。计算各组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3 mRNA表达量。

1.3.6 蛋白质印迹法检测Kupffer细胞mTORC1、STAT3蛋白表达 每RIPA裂解液1 mL加入5×106个Kupffer细胞，吹打均匀，14 000 r/min，4 ℃下离心8 min。为避免蛋白降解，在冰台上，取上清液二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，对样品上样量的终浓度调整为50～80 μg/μL。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法电泳分离蛋白，湿转膜法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，加入含5%脱脂奶粉封闭液，常温下平摇1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜后，加入提前配制好的一抗稀释液(mTORC1 1∶5 000稀释；STAT3 1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育后，再次PBS洗膜除去过量的一抗稀释液，加二抗稀释液(HRP羊抗兔IgG抗体)(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，洗膜后，进行化学发光反应。用Quantity One软件分析GAPDH与目的蛋白mTORC1、STAT3的光密度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 空白组大鼠体型适中，皮毛光亮，动作灵活，反应敏捷。模型组大鼠体型肥胖，皮毛枯黄，动作迟钝，鼠笼敷料潮湿，饮水量多，大便溏软，易激惹咬噬。参苓白术散低、高剂量组大鼠精神状态、体型、毛发光泽度、行为反应性、排泄物等情况介于正常组与模型组大鼠之间。其中参苓白术散高剂量大鼠体型普遍较小于参苓白术散低剂量组，在精神状态、毛发光泽度、行为反应方面也优于参苓白术散低剂量组。

2.2 各组大鼠肝组织病理学观察

2.2.1 油红O脂肪染色 空白组细胞核蓝染，染色后细胞浆中红色油滴不明显。模型组蓝染的细胞核若隐若现于细胞中，染色后，胞质中可见大量红色油滴，部分融合。参苓白术散低、高剂量组肝组织染色脂滴红染面积及程度较模型组明显缩小和减轻，参苓白术散高剂量组肝组织形态最接近空白组。见封3，图1。

2.2.2 HE染色 空白组细胞核蓝染，核大而圆，居中，胞浆均匀红染，胞内无脂肪空泡，肝索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，结构清晰，排列规则，未见炎症细胞浸润或坏死灶。模型组肝细胞肿胀或膨大，呈气球样变，细胞核被脂肪空泡挤压于一侧，肝窦、肝索结构排列紊乱，肝窦受压变窄，汇管区可见大量炎症细胞浸润，视野内有散在的点状坏死灶。参苓白术散低、高剂量组在肝细胞形态、肝索排列、气球样变、炎症细胞浸润及点状坏死灶方面，较模型组有不同程度改善，其中参苓白术散高剂量组肝组织病理学变化改善最显著。见封3，图2。

组 别nTCTG空白组102.06±0.300.73±0.11模型组104.50±0.60∗1.21±0.16∗参苓白术散低剂量组103.53±0.94△1.07±0.10△参苓白术散高剂量组102.48±0.84△#0.96±0.13△#

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与参苓白术散低剂量组比较，#P<0.05

由表1可见，模型组大鼠TC、TG较空白组升高(P<0.05)，说明造模成功。参苓白术散低、高剂量组大鼠TC、TG较模型组降低(P<0.05)，说明治疗有效，参苓白术散高剂量组较参苓白术散低剂量组降低更明显(P<0.05)。

2.4 各组大鼠Kupffer细胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6比较 见表2。

组 别nTNF-αIL-1βIL-5IL-6空白组1097.87±14.1573.27±27.31102.53±16.4098.45±18.36模型组10351.74±21.72∗177.76±21.33∗251.30±24.61∗260.77±19.33∗参苓白术散低剂量组10187.89±20.59△112.99±13.75△163.23±21.69△187.09±23.90△参苓白术散高剂量组10143.85±14.09△#100.77±20.97△#147.85±16.36△#113.58±15.56△#

与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与参苓白术散低剂量组比较，#P<0.05

由表2可见，模型组大鼠Kupffer细胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6均较空白组升高(P<0.05)；参苓白术散低、高剂量组大鼠Kupffer细胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6均较模型组降低(P<0.05)，说明治疗有效，参苓白术散高剂量组较参苓白术散低剂量组降低更明显(P<0.05)。

2.5 各组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3 mRNA表达比较 见表3。

组 别nmTORC1 mRNASTAT3 mRNA空白组101.11±0.901.08±0.59模型组105.54±1.17∗3.39±1.01∗参苓白术散低剂量组104.12±1.21△2.66±0.94△参苓白术散高剂量组102.05±1.06△#1.75±0.88△#

与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与参苓白术散低剂量组比较，#P<0.05

由表3可见，模型组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3 mRNA表达均较空白组升高(P<0.05)；参苓白术散低、高剂量组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3 mRNA表达均较模型组降低(P<0.05)，参苓白术散高剂量组较参苓白术散低剂量组降低更明显(P<0.05)。

2.6 各组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3蛋白表达比较 见表4、图3。

组 别nmTORC1蛋白STAT3蛋白空白组100.61±0.090.57±0.06模型组101.71±0.13∗1.03±0.10∗参苓白术散低剂量组101.42±0.10△0.93±0.07△参苓白术散高剂量组101.22±0.10△#0.85±0.06△#

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与参苓白术散低剂量组比较，#P<0.05

由表4可见，模型组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3蛋白表达均较空白组升高(P<0.05)；参苓白术散低、高剂量组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3蛋白表达均较模型组降低(P<0.05)，且参苓白术散高剂量组较参苓白术散低剂量组降低更明显(P<0.05)。

A空白组；B模型组；C参苓白术散低剂量组；D参苓白术散高剂量组

图3 各组大鼠Kupffer细胞mTORC1、STAT3蛋白表达

3 讨 论

近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，NAFLD发病率呈上升趋势，发病年龄也日趋年轻[11]。此类人群的生活习惯若不改变及得不到有效药物的治疗，后期可发展为肝硬化、肝癌[12-13]。肝脏Kupffer细胞位于肝血窦内，是人体内最大的固定巨噬细胞群，约占肝脏所有细胞总数的15%，占全身巨噬细胞总数的80%～90%[14]。Kupffer细胞具有吞噬微生物、清除内毒素、摄取抗原并激发获得性免疫的作用，它还能释放过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)，将中性粒细胞和淋巴细胞等炎性反应细胞聚集在肝内，并释放炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6等[15-16]，引起肝脏炎性反应。

mTOR是一种非典型丝/苏氨酸蛋白激酶，主要通过与不同的适配子结合形成2种主要复合物：mTORC1和mTORC2。目前对mTORC1的研究更为深入，其在调节脂质代谢中发挥重要作用[17]。当mTOR被激活时，其复合物可通过促进脂肪及关闭分解代谢过程(如脂肪分解和β-氧化)来促进TG的积累，进而促进细胞内脂质含量增加[18-19]。研究证实，高脂饮食是NAFLD发病的重要诱导因素，摄入过高的脂肪可使mTOR通路处于持续激活状态，导致mTORC1合成增加，促进肝脏炎症发生[20]。NAFLD大鼠mTORC1和TNF-α、IL-6、IL-5及IL-1β均处于高水平表达或分泌[21-23]，可见mTORC1是炎症发生的关键靶向分子蛋白。

STAT3作为重要的转录因子，亦参与肝脏脂质代谢，其在脂肪肝中激活显著升高[24]。同时STAT3作为形成肝脏炎性微环境的重要炎症介质，其调控炎性反应的机制日益受到医学研究的重视[25-26]。研究表明，STAT3的异常表达及活化导致炎症微环境的形成，促进了脂质积累，是发生NAFLD的关键因素[27]。Hye-Young Seo等[28]研究发现，在由脂多糖(LPS)诱导形成的NAFLD大鼠模型的肝组织中，炎症病灶STAT3高表达，同时伴有IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌量增加，使用咖啡豆醇可抑制STAT3的活化，进而降低IL-6、TNF-α、和IL-1β的分泌，缓解NAFLD大鼠肝脏的炎性反应。Fredholm S[29]研究表明，STAT3的高表达促进了IL-5的分泌。此外，mTOR与STAT3关系密切，mTOR可抑制核转录因子-κB(NF-κB)信号通路，促进STAT3的活化[30]，两者相互作用以控制和优化免疫反应[31]。因此，选择适当的药物阻断mTORC1、STAT3靶点，抑制TNF-α、IL-1β、IL-5和IL-6分泌，对防治NAFLD意义重大。

中医学无NAFLD这一病名，将其归为胁痛、肝着、肝癖等范畴。中华中医药学会脾胃病分会在《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见(2017)》中指出，NAFLD病因主要有饮食失衡、劳逸失度、情志不节等，病机以脾肾亏虚为主，主要病理因素是痰、湿、浊、瘀，在分期论治中，初期疏肝理气、健脾和胃，中后期健脾益肾、化瘀散结，可见脾虚失运是关键病机之一，健脾法贯穿始终[32-33]。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，方中人参大补脾胃，白术、茯苓健脾渗湿，共为君药。山药、莲子二药助人参、白术健补中州，厚肠止泻；白扁豆、薏苡仁既能健脾，又可渗湿，此四药共为臣药。佐以砂仁芳香醒脾行气，畅达中焦气机；桔梗宣通上焦肺气，通利水道，有助健脾除湿之力。炙甘草和中，调和诸药，为使药。全方具有健脾、益气、渗湿功效。

本研究结果提示，模型组大鼠肝脏脂质蓄积及脂肪变性，存在严重的脂质代谢紊乱，Kupffer细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-5含量升高，mTORC1、STAT3 mRNA及蛋白表达上调。不同剂量参苓白术散干预后，大鼠脂质代谢及炎性反应有不同程度的减轻，mTORC1和STAT3 mRNA及蛋白表达下调，其中以参苓白术散高剂量组效果较为显著，说明参苓白术散改善肝脏脂肪沉积及炎性反应可能与剂量有一定的相关性。

综上所述，参苓白术散防治NAFLD，可能与抑制mTORC1、STAT3 mRNA及蛋白表达，减少炎症介质产生，改善肝细胞变性程度有关。