二代测序在1例肝脓肿合并血流感染患者病原体检测中的应用

黄 宇， 张志华， 郝长来

(承德医学院附属医院血液内科， 河北 承德 067000)

1 临床资料

患者男，59岁，因“发热6d”于2019年4月8日入院。患者6d前出现发热，体温最高40℃，伴畏寒、寒战，伴恶心、呕吐，无腹痛、腹泻。既往2型糖尿病病史。查体：T 36.8℃，P 120次/分，R 28次/分，BP 170/106mmHg，神志清楚，皮肤、巩膜无黄染，双肺呼吸音清，未闻及干湿性啰音，心律齐，腹软，无压痛，肝脾未触及，肝区叩击痛。急诊实验室检查：血常规：白细胞计数(WBC)31.13×109L-1，血红蛋白145g/L，血小板计数(PLT)8×109L-1，中性粒细胞比率(NEUT)测不出，中性晚幼粒细胞6%，中性杆状核粒细胞13%，中性分叶核粒细胞79%，单核细胞2%；C-反应蛋白(CRP)157.19mg/L；降钙素原(PCT)>100ng/mL(表1)；肝功能：总胆红素37.81umoL/L，谷丙转氨酶104.00U/L，谷草转氨酶96.82U/L；血糖24.67mmoL/L。腹部CT提示肝实质密度减低，肝右叶点片状气体密度灶(图2A)。以“血小板减少症”转入血液科。

当日下午患者出现高热、寒战及休克，给予美罗培南1g 每8小时1次联合替硝唑0.8g 每12小时1次抗感染及降糖、补液等治疗，并在B超定位下行经皮肝脓肿穿刺置管引流术(图1)，送检脓液和血液行微生物培养，同时送血样进行NGS检测(细菌、真菌、病毒、支原体/衣原体、寄生虫、结核分枝杆菌复合群)。分别于入院第3天、第4天脓液及血液培养回报：产酸克雷伯菌，药物敏感实验均提示美罗培南、头孢孟多、头孢哌酮舒巴坦钠等常用抗感染药物敏感。NGS回报为肺炎克雷伯菌和变栖克雷伯菌(表2)。入院第5天以“肝脓肿”转入普外科，停用美罗培南，换用头孢孟多酯钠2g每8小时1次抗感染治疗。

表1 实验室指标变化

*：测不出 -：无

表2 血液NGS结果

入院第3天、第4天送检的血培养回报阴性，NGS仍检测到大量克雷伯菌属，但序列数较前下降。入院第8天患者仍有发热，体温最高38.8℃，复查血常规：WBC 13.28×109L-1，PLT 304×109L-1， NEUT 83.0%；CRP 81.25mg/L；PCT 1.27ng/ml。再次送检血培养结果阴性，NGS检测到克雷伯菌属序列数较前无明显减少，故停用头孢孟多酯钠，换用头孢哌酮舒巴坦钠3g每12小时1次抗感染治疗。

入院第11天，患者病情有所改善，复查血常规：WBC12.94×109L-1，PLT300×109L-1，NEUT 88.9%；CRP 115.18mg/L；PCT 1.13ng/ml。继续送检血培养回报阴性，NGS检测到克雷伯菌属序列数较前下降。入院第15天，患者发热频率及热峰较前下降，脓液引流量逐渐减少，复查腹部CT提示病变范围较前缩小(图2B)。血常规：WBC 7.49×109L-1，PLT 329×109L-1，NEUT 77.2%；CRP 92.86mg/L；PCT 0.72ng/ml。入院第18天，患者体温降至正常，复查血常规：WBC 5.21×109L-1，PLT 290×109L-1，NEUT 55.90%；PCT 0.02ng/ml，血培养阴性， NGS检测到少量克雷伯菌属。此后患者未再发热。入院第22天，患者好转出院。

图1 超声定位下经皮肝脓肿穿刺图像

右肝后叶可见范围约64.6mm×55.3mm×65.3mm强回声，由多发气体强回声组成，后方伴声影，边界尚清楚，形态不规整。

图2 治疗前后肝脓肿CT图像

图2 A肝实质密度减低，肝右叶点片状气体密度灶 ；图2B肝脓肿治疗后改变

2 讨 论

细菌性肝脓肿是肝实质的液化性坏死，常见致病菌为肺炎克雷伯菌[1]。肝脓肿主要表现是发热、腹痛、寒战，而右上腹压痛、肝区叩击痛、肝肿大等体征发生率较低，提示疾病部位的症状体征少，缺乏特异性，增加了临床诊断的难度。如果诊断治疗不及时， 病死率较高， 导致死亡主要原因是血流感染或感染性休克。早期诊断不仅需要详细的病史及针对性的检查，还需动态观察患者病情，必要时可行细菌培养或穿刺病检明确。早期排脓及使用抗菌药物可减少并发症的发生，降低病死率，经皮穿刺置管引流术是临床治疗的首选[2]。

NGS是一种新兴的病原体检测技术，具有精准、快速、灵敏度高、可定量分析的优点[3]。近年来NGS被广泛用于多种感染性疾病的诊断，均表现出良好的诊断性能[4]。目前，二代测序在感染性疾病方面的研究仍集中于病原体鉴定，在感染性疾病诊断中，其准确、非选择性的特点较好地补充了传统病原学诊断方法的不足，有一定的临床应用价值。然而，在病原体序列数与病情变化的相关性方面的研究较少，其定量分析优势尚未发挥。Ai等人报道了4例具有类似中枢神经系统感染症状的病例，其中NGS既用于未知病因诊断，又用于对中枢神经系统感染中病原菌负荷的动态定量监测，密切反映了疾病的进展情况[5]。Yongfeng Hu等人采集1例甲型流感(H7N9)病毒感染后患者不同时间点支气管肺泡灌洗液行二代测序检测，通过病毒载量变化评估抗病毒治疗效果，此外，监测到病毒序列数明显减少时，出现鲍曼不动杆菌序列，且随着病毒序列减少而增多，揭示病毒入侵后继发细菌感染，指导临床给予针对性治疗。

在本研究中，我们有效利用NGS的可定量分析特点，用于对血流感染中病原体负荷的动态定量监测，并指导临床治疗。本例患者脓液及血液培养均为产酸克雷伯菌，NGS结果与培养在种水平不同，可能与现有的微生物分子分型及表型鉴定方法不一致有关[6]。在治疗过程中我们发现，传统微生物培养阳性率容易受抗菌药物使用的影响，常规实验室感染指标难以精准评估疾病进展及指导临床治疗。NGS不依赖病原体分离培养，能够准确、高效地获得病原体的基因信息，可以得到样本中丰度较低甚至是微量病原体信息。因此，尽管抗感染治疗后血培养均为阴性， NGS以其灵敏度高及定量优势，极大的帮助了临床医师判断患者病情进展，指导抗菌治疗，避免过度治疗的发生。NGS检测过程中，直接提取样本中的全部核酸片段进行检测，获得病原体的序列数、覆盖度等定量分析数据，因此死菌释放的DNA也可被检出，不能确定检测的细菌是否已经死亡。但游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)的半衰期短至数分钟，使病原体序列数与病情变化高度相关，即使检出的是已死亡的病原体，对指导临床进行针对性的治疗也有重要意义，可以提高细菌培养阴性样本中的病原体检出率。希望随着二代测序技术的逐步普及，有更多的循证医学证据支持二代测序技术的定量分析优势，从而推动其临床应用。