子宫内膜息肉中miR-210和HIF-1α的表达及意义

凌 玲， 徐桂琴， 倪 娜

(南京医科大学附属江宁医院妇产科， 江苏 南京 211100)

子宫内膜息肉(Endometrial polyps，EP)是临床常见的由局部子宫内膜过度增生引起的妇科疾病，以子宫腹痛、异常出血、不孕为临床表现，给女性带来极大心理负担并威胁身体健康[1]。目前，多数专家认为EP进程与机体细胞因子、雌激素受体(Estrogen receptor，ER)及孕激素受体(Progesterone receptor，PR)表达异常密切相关[2]。微小RNA-210(miRNA-210，miR-210)是一种缺氧特异性miRNA，miR-210-3p是miR-210成员之一，在子宫内膜异位症中呈高表达，其有可能是治疗子宫内膜异位症的潜在靶标[3]。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在子宫内膜异位症中呈高表达，参与子宫内膜异位症的发生与发展[4]。子宫内膜息肉与子宫内膜异位症类似，是与血管新生密切相关的激素依赖性疾病[5]，但miR-210、HIF-1α在子宫内膜息肉中的研究尚未报道。因此，本研究拟通过观察子宫内膜息肉中miR-210、HIF-1α表达水平，并分析miR-210、HIF-1α的关系及与ER、PR、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的相关性，以期为EP患者早期诊治提供生物学指标。

1 资料与方法

1.1临床资料:选取2018年6月至2019年5月本院经宫腔镜确诊且接受切除子宫内膜息肉的62例子宫内膜息肉患者为息肉组，年龄29～46岁，平均年龄(36.56±6.22)岁；并以同时间段内因不孕症或子宫畸形进行宫腔镜检查并排除EP的正常子宫内膜患者62例为正常内膜组，年龄30～44岁，平均年龄(35.98±6.05)岁。两组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本项研究经本院伦理委员会审核、批准后进行实施。诊断标准：EP患者均符合相关诊断标准[6]。纳入标准：①符合EP诊断标准；②病理资料完全者；③所有受试者签署知情同意书。排除标准：①患有子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜结核、子宫内膜癌者；②近三个月内服用过激素药物者；③合并自身免疫性疾病、感染性疾病、恶性肿瘤者；④合并心、肝、肺、肾等重要器官功能障碍者；⑤子宫内曾置入节育器者；⑥近期行宫颈操作者。

1.2主要试剂:人催乳素(Prolactin，PRL)酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购买于上海纪宁实业有限公司；雌二醇(Estradiol，E2)ELISA试剂盒购买于上海晶抗生物工程有限公司；睾酮(Testosterone，T)ELISA试剂盒、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)ELISA试剂盒、孕酮(Progesterone，P)ELISA试剂盒均购买于武汉默沙克生物科技有限公司；TRIzol TM分离试剂、Taq Man Micro RNA reverse transcription kit、Taqman Universal master mix、Taq Man MicroRNA Assay检测试剂均购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3方 法

1.3.1样品采集及预处理:①所有受试者清晨空腹抽血5mL(月经周期正常者在月经3～5d抽血，月经周期紊乱者在宫腔镜术前抽血)，置于10mL EP管中，4000r/min离心12min，分离上层血清，于-20℃冰箱中保存，待检。②EP患者行宫腔镜检查时取息肉组织，对照组取子宫内膜组织。将所有组织标本用生理盐水迅速清洗，分成两份，一份立即置于液氮罐中，之后保存于-80℃冰箱中；另一份用福尔马林固定进行病理检查(经病理诊断确定正常增生期内膜或子宫内膜息肉)。

1.3.2采用ELISA法检测血清五项性激素:采用ELISA法检测所有受试者血清PRL、E2、T、FSH、P五项性激素水平，所有操作严格依照试剂说明书实施。

1.3.3qRT-PCR法检测各组织中miR-210、HIF-1α、ER、PR、VEGF表达水平:取出冻存于-80℃冰箱中的组织样本200mg，于冰上研钵内研磨，加1mL TRIzol TM试剂，依照TRIzol试剂说明书提取组织总RNA，将提取的RNA依照Taq Man Micro RNA reverse transcription kit说明书将其反转录成cDNA，之后以1μL cDNA模板，按照Taqman Universal master mix、Taq Man MicroRNA Assay说明书进行扩增、PCR检测。各检测目标及内参引物序列见表1。反应体系：2×Master mix 10 μL、cDNA 1μL、PCR forward primer 0.6μL、PCR reverse primer 0.6μL、20×SYBRI 1 μL、加无RNase H2O至总体积为20 μL。反应条件设置：97℃预热5min，95℃变性45s，63℃退火45s，40个循环。miR-210以U6为内参，HIF-1α、ER、PR、VEGF均以β-actin为内参。以2-△△CT法计算miR-210、HIF-1α、ER、PR、VEGF相对表达水平,见表1。

表1 miR-210 HIF-1α ER PR VEGF及内参U6 β-actin的引物序列

2 结 果

2.1两组患者血清中五项激素水平比较:两组受试者血清中PRL、E2、T、P、FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组五项激素水平比较

2.2两组患者组织中miR-210、HIF-1α、ER、VEGF表达水平比较:与正常内膜组相比，息肉组患者组织中miR-210、HIF-1α、ER、VEGF表达水平均明显升高(P<0.05)，PR表达水平降低(P<0.05)，见表3。

2.3EP患者息肉组织中miR-210、HIF-1α与ER、PR、VEGF的相关性:经Pearson相关性分析显示，EP患者息肉组织中miR-210表达水平与VEGF呈正相关(P<0.05)；HIF-1α表达水平与ER、VEGF表达水平呈正相关(P<0.05)，与PR表达水平呈负相关(P<0.05)，见表4。

表3 两组miR-210 HIF-1α ER PR VEGF表达水平比较

表4 EP患者息肉组织中miR-210 HIF-1α与ER PR VEGF的相关性

2.4EP患者息肉组织中miR-210与HIF-1α的相关性:Pearson相关性分析显示，EP患者息肉组织中miR-210表达水平与HIF-1α呈正相关(r=0.518，P<0.05)。详见图1。

图1 EP患者息肉组织中miR-210与HIF-1α的相关性

3 讨 论

EP是一种妇科常见的子宫内膜疾病，可引起子宫异常出血、不孕等临床症状，具有雌激素依赖性，具有发病率、复发率高的特点，有子宫内膜癌癌变倾向，严重危害女性健康，并给患者家庭带来极大经济负担和心理压力[7]。因此，寻找高效确诊EP发生的临床指标，并给予患者合理的治疗方案，对改善患者生活质量具有重大意义。

miRNA是机体内一类具有高度保守的单链、非编码小分子RNA，通过碱基互补配对方式与靶基因mRNA的3'端非编码区结合，从而调控基因、蛋白表达，影响一系列生物学过程[8]。有关研究发现miR-205与子宫内膜癌发生与发展紧密相关[9]；Pateisky等[10]发现miRNA-154-5p可作为子宫内膜异位症患者的潜在诊断标志物；以上研究表明子宫内膜疾病发生进展与miRNA表达失调有关。miR-210是一种具有较高稳定性及功能多样性的缺氧特异性miRNA，可影响血管新生。本研究显示，子宫内膜息肉组织中miR-210水平显著高于正常子宫内膜组织，与miR-210在子宫内膜异位症中表达趋势一致，提示miR-210可能参与EP的形成与发展。多数学者认为，子宫内膜组织长时间遭受雌激素刺激，孕激素不足与EP发生有关；此外，VEGF可促使纤维组织伴厚壁血管形成，参与EP发生与发展，EP患者子宫内膜息肉组织ER、VEGF表达上调，PR下调[11]，提示EP的发生与ER、PR、VEGF的失调相关。本研究显示，子宫内膜息肉组织中ER、VEGF呈高表达，PR呈低表达，与上述研究类似。进一步研究分析发现miR-210表达水平与VEGF表达水平呈正相关，提示miR-210可能与VEGF相互作用共同调控EP的发生。

HIF-1α是机体应答缺氧环境的关键因子，可通过调控新血管生成、雌激素产生、炎症因子等相关基因，参与子宫内膜异位症的发生与发展[12]。王淑贞等[13]研究发现HIF-1α、VEGF在子宫内膜癌中表达上调，且与VEGF存在一定相关性。以上研究提示HIF-1α在子宫内膜病变中发挥一定作用。本研究结果显示，EP患者子宫内膜息肉组织中HIF-1α表达水平上调，与上述研究趋势相符，提示HIF-1α对EP发生起到重要作用。有关研究显示，HIF-1α表达异常与ER、PR、VEGF存在一定联系[13,14]。本研究显示HIF-1α表达水平与ER、VEGF表达水平呈正相关，与PR表达水平呈负相关，提示HIF-1α与ER、PR、VEGF相互影响一起参与EP发生与发展进程。进一步研究发现，miR-210与HIF-1α呈正相关，提示miR-210、HIF-1α相互作用，共同参与EP的形成与发展。

综上所述，miR-210、HIF-1α在EP形成中均表达上调，且两者呈正相关，两者对EP形成具有一定评估价值。但本研究样本量较少，结果可能存在一定偏倚，后续将扩大样本量进一步研究。