结核分枝杆菌检测试剂盒优化方案对结核分枝杆菌的诊断价值

胡佳娜，范大鹏，陈园园，鲍志坚，蔡龙

（浙江中医药大学附属中西医结合医院，浙江 杭州 310003）

肺结核仍是全世界最严重的慢性传染病之一，我国也是肺结核较严重的国家之一。2018年WTO相关报告显示，我国结核病患者每年增加约88.9万[1]。PCR-荧光探针法、结核RNA恒温扩增技术目前已是结核分子诊断中较普遍的检测技术[2]，PCR-荧光探针法用于检测结核分枝杆菌的DNA，具有难以区分死菌和活菌的缺点[3]；结核分枝杆菌的mRNA半衰期非常短，在常温中容易降解[4]，在常规操作中可能会导致一定的RNA流失，降低所测标本的阳性率，造成活动性肺结核的漏诊；MGIT 960液体快速培养周期长，通常需要1-2个月的时间，无法达到“快速确诊”的目的。本研究通过结核分枝杆菌检测试剂盒（TB-SAT）优化方案与已有的常规检测法作对比，以临床诊断为金标准，探讨优化方案的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年12月在本院收治的105例疑似肺结核患者的肺泡灌洗液标本，其中男66 例，女 39 例，年龄 17-83 岁，平均（45.7±19.1）岁。所有患者经临床表现，痰找抗酸杆菌检测及胸部CT检查等方式，结合 《肺结核诊断标准（WS 288-2017）》[5-6]确诊105例中肺结核75例，非肺结核30例。

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌检测试剂盒（TB-SAT）优化方案 核酸提纯步骤如下：（1）处理样本：灌洗液样本依照1:1或1:2比例添加保存液，混匀后放在温度为95℃水浴，10分钟，然后超声15分钟，使灌洗液标本充分液化和达到菌体破碎的效果；（2）将处理过的样本转移至1.5mL离心管中，加入200μL矿物油吸磁弃上清；（3）在上述离心管里中加入300μLDEPC水，震荡混匀，60℃水浴 5分钟，吸磁后取上清到新的1.5mL离心管中；（4）分别在上述离心管里加入200μL病毒核酸提纯液，对其混匀，在60℃环境下孵育10分钟，后在室温中静置10分钟；（5）将上述离心管放入离心机中短暂离心后，置于磁珠分离仪器上，待清晰发现磁珠到达管壁后使用移液器将管中以及盖上的液体吸出，并将气泡排除去，留下磁珠；（6）将吸干后的样本管移离磁力架，加入 1mL洗涤剂重悬磁珠，重复步骤（5）；（7）重复步骤（6），此步骤尽量去除可见的残余液体，以免影响后续反应，然后室温干燥2分钟；（8）将样本管移离磁力架，之后往各管中加入30μLTB-SAT核酸扩增检测液，重悬磁珠，将磁珠悬液全部转到新的八连管，并盖上盖子。核酸提纯后进行SAT操作：60℃加热10分钟后，立即在42℃保持5分钟，加酶后上PCR仪器，程序设定与原RNA恒温扩增检查试剂一样。结果判读：与RNA恒温扩增检测的结果判读方法一样，有标准的S曲线并且Ct值＜40判定为阳性，＞40判定为阴性。

1.2.2 对比试验 （1）RNA恒温扩增检测。使用结核分枝杆菌RNA恒温扩增试剂盒检测，完全按照说明书进行操作，并根据说明书进行结果判读。（试剂购自上海仁度生物科技有限公司，批号：20191101）。（2）PCR-荧光探针法。使用晶芯结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，完全按照说明书操作并进行结果判读。（试剂购自成都博奥晶芯生物技术有限公司，批号：20190701）。（3）MGIT 960液体快速培养。采用美国BD公司试剂，操作步骤及结果判读参照《结核病实验室检验规程》[7]。

1.3 统计学处理 使用SPSS 26.0对以上几种检测结果的诊断效能进行比较，计数资料用百分率表示，采用 χ2检验。

2 结果

TB-SAT优化方案较RNA恒温扩增检测、PCR-荧光探针法及MGIT 960液体快速培养阳性率升高。以临床诊断为金标准，TB-SAT优化方案的灵敏度为73.33%。TB-SAT优化方案，RNA恒温扩增检测及PCR-荧光探针法特异度均为100.00%，MGIT 960液体快速培养的特异度为93.33%。详见表1。

表1 不同检测方法诊断结果

3 讨论

结核分枝杆菌检测试剂盒优化方案的本质是RNA的核酸提纯方法的优化，此方法能减少RNA在实验操作过程中的降解，提高了RNA的检出率，对原分子检测的方法是一种互补。优化方案试剂中的保存液的功能主要为液化标本，延长RNA的降解时间，降低RNA的降解率，对RNA起到一定的保护作用，此为TB-SAT优化方案中的核心试剂，在此方案中起着关键的作用，大大提高阳性率。

TB-SAT优化方案与MGIT液体快速培养比较可看出TB-SAT优化方案阳性率高出培养结果，因此只用培养结果作为肺结核病原学阳性统计标准可能存在漏诊，应联合分子生物学来提高临床诊断中的病原学阳性率[8]。非肺结核患者中存在2例MGIT 960培养阳性结果，分析原因，其中1例为非结核分枝杆菌，而TB-SAT优化方案只能检测出结核分歧杆菌，相比MGIT 960快速培养提高了检测的特异度；另1例，培养结果为结核分枝杆菌，其阳性原因可能与标本保存不当，未处理标本前RNA已经降解有关。TB-SAT优化方案作为一种分子生物学手段，具有快速、简便等优点，相比细菌学培养结果在阳性率方面低于分子生物学手段，但结核菌培养具有不可替代的价值，结核药敏和非结核MIC药敏法等都需要用培养出的菌株才能进行检测[9]。此外细菌学的表型药敏结果与生物学的基因型药敏结果结合考虑，有利于个体化的抗结核治疗方案综合全面的制定，已达到更高的治疗效果[10]。本研究对TB-SAT优化方案、RNA恒温扩增检测技术、PCR-荧光探针法和MGIT 960液体快速培养进行了分析比较，探讨结核分枝杆菌TB-SAT优化方案的检测价值，研究结果显示TB-SAT优化方案的诊断灵敏度73.33%，特异度100%，诊断效能较高，可能与优化方案中的保存液有关。在保存液的作用下RNA的降解率降低，检出率得到了提高。从以上结果分析可得TB-SAT优化方案可及时发现活动性肺结核，诊断灵敏度及特异性高，可帮助降低肺结核的漏诊率，具有一定的临床推广价值。