EBUS-TBNA标本检测荧光定量TB-PCR对纵隔淋巴结核的诊断价值

张红军 杨巧娟 张海涛 苏 蔚 谢永宏 金发光 顾 兴

超声支气管镜引导下经支气管透壁针吸活检(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)是一项成熟、安全、微创和精准的内镜检查技术，已成为纵隔和肺门的占位、肿大淋巴结等病变诊断的首选方法[1-4]，特别是在全身麻醉技术应用到EBUS-TBNA后，其在临床上得到了广泛开展[5-8]。对于纵隔和肺门淋巴结结核，尤其是那些以单纯肺门及纵隔病变为主，而肺内又无明显病灶的淋巴结结核患者，通过影像学或血清特异标志物与恶性疾病相鉴别，是极为困难的[9-13]；而且，在纵隔及肺门的良性病变中，最为常见的是淋巴结结核和结节病，但二者共同的病理学特征均为坏死性肉芽肿性炎，而他们咳嗽、胸痛、胸闷、低热等呼吸道症状也无特异性，因此，通过临床症状、T-SPOT、穿刺液查结核杆菌DNA及病理活检等方法很难进行鉴别[14-15]。自2017年1月起，我院成功开展了EBUS-TBNA标本送检分枝杆菌菌种鉴定(DNA微阵列芯片法)，该方法对淋巴结结核和结节病，以及肺门淋巴结结核和恶性肿瘤的鉴别提供了很大的帮助。现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选择2017年1月至2018年6月在空军军医大学第二附属医院呼吸内镜中心接受EBUS-TBNA的患者65例，其中，男性33例(50.8%)，女性32例(49.2%)；年龄小于等于60岁者35例(53.8%)，年龄大于60岁者30例(46.2%)；恶性肿瘤31例(47.7%)，非恶性肿瘤患者34例(52.3%)。对所有患者的影像学特征，以及血清T-spot、血清肿瘤标志物、病理结果和荧光定量TB-PCR检测等资料进行回顾性分析，揭示其规律性。所有患者在术前自愿签署支气管镜检查知情同意书，均无下列麻醉禁忌证：①严重心律失常或心肌缺血；②不能控制的高血压(EBUS-TBNA穿刺收缩压>180 mmHg)；③凝血时间显著异常，APTT延长1倍以上；④对麻醉药物过敏；⑤重度呼吸困难；⑥严重的脏器功能不全；⑦孕妇；⑧近3月内患有严重的出血性疾病及血栓性疾病[16-18]。

所有患者术前均进行胸部增强CT扫描检查，提示患有肺门旁占位、肺门淋巴结肿大和/或纵膈占位、纵膈淋巴结肿大等病变。术前进行常规检查，如血常规、凝血系列、心电图，部分合并冠心病、高血压患者进行心电图和/或心脏彩超，合并COPD或肺心病患者行血气分析和/或肺功能检查，评估无明显手术禁忌[8，12，19-20]。

二、麻醉方式

常规建立静脉通路，适当进行补液，并行心电监护(包括心率、血压、血氧饱和度及呼吸等)及呼末CO2监测。同时，给予面罩给氧，保持血氧饱和度SpO2在98%～100%。随后给予注射用甲泼尼龙琥珀酸钠40 mg静滴以抗炎及预防过敏，盐酸托烷司琼注射液5 mg静推以预防呕吐。采用全凭静脉麻醉，给予丙泊酚注射液2～3 mg/kg，注射用盐酸瑞芬太尼1～2 μg/kg进行麻醉诱导，待意识消失以后给予罗库溴胺注射液0.6 mg/kg，等待肌松起效后置入喉罩(男性4号，女性3号)，术中采用高频喷射通气，呼吸18～20次/min，吸/呼比1︰2，喷射压力0.35兆帕。麻醉维持静脉持续滴注丙泊酚注射液4～5 mg/kg/h，注射用盐酸瑞芬太尼0.1～0.2 μg/kg/min，注意术中调节丙泊酚注射液泵入量，使麻醉深度BIS值(bispectral index, BIS)维持在40～50之间。于穿刺结束前5 min停药，患者自主呼吸恢复，意识转清楚后再拔除喉罩。继续观察15～30 min，如患者无麻醉并发症发生，即送回病房，接受后续处理[21-22]。

三、手术方法

经喉罩插入超声支气管镜，其手术操作要点：①将超声支气管在声门裂上方12点方向插入气管；②向水囊内注入0.3～0.5 ml无菌生理盐水；③根据影像学检查择点定位，将探头贴紧支气管壁扫描淋巴结，用多普勒超声确认淋巴结与周围血管的位置关系，然后探测淋巴结内部结构，如回声强弱、血管多寡及淋巴结大小等，切记动作轻柔；④确定合适的穿刺路径，成功避开血管，选择22G穿刺针，连同针芯一并插入内镜工作通道；⑤将穿刺针固定好，并按病灶大小确定进针深度，然后将穿刺针快速插入病灶内部，在负压注射器保持负压5～15 ml下，反复在病灶中提抽20～30次。抽吸标本送呼吸科实验室行分枝杆菌菌种鉴定(DNA微阵列芯片法)，并常规行细胞学及病理学检查，部分标本进行免疫组化标记[23]。

四、病理诊断及抗酸染色

抽吸样本立即送病理科，要求先离心后固定于甲醛溶液并石蜡包埋。然后进行HE染色，必要时进一步行免疫组化检测以协助诊断并依据免疫组化结果进行相关肿瘤分型。抗酸染色采用Ziehl-Neelsen染色法。

五、抽吸标本结核杆菌DNA微阵列芯片法检测

1. 组织DNA提取及纯化： 采用DNeasy® Blood & Tissue Kit(QIAGEN，GERMANY)，按照其说明书进行EBUS-TBNA穿刺组织DNA提取及纯化。得到的DNA样本用于下一步检测或-80 ℃保存备用。

2. PCR扩增： 选用博奥生物集团有限公司的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)进行PCR扩增。首先，选取10 μl的PCR扩增试剂。其次，将上一步提取好的DNA组织液2 μl加入相应PCR管内，立即混匀，然后瞬时离心。第三，确认PCR管盖盖紧，将其至于PCR扩增仪(ETC811，苏州东胜兴业科学仪器有限公司)中进行PCR扩增反应。注意，反应热循环程序必须严格按照试剂盒说明书进行设置。

3. 芯片杂交： 待扩增反应结束后直接将扩增产物至于PCR仪中(95 ℃)，变性5 min后立刻将扩增产物进行冰浴(至少3 min)。然后将变性完成的产物按照试剂盒要求进行加样。最后密封好杂交盒(50 ℃，杂交时间为2 h)。

4. 芯片洗涤与干燥： 经2 h的杂交反应后将芯片取出，立即将其放入芯片洗干仪(SlideWasherTM8，博奥生物集团有限公司)内，给予洗涤液Ⅰ进行洗涤1次，频率为120 s/次。其次，给予洗涤液Ⅱ洗涤2次，频率为60 s/次。最后，取出芯片，将其放入离心甩干机内进行离心干燥(30 s)，待甩干后予以扫描。

5. 芯片扫描及结果判读： 使用博奥生物集团有限公司的微阵列芯片扫描仪(LuxScan 10K-B)和相应软件进行信号的读取和结果的判读。检测样本的相应内参及对照结果均正常，结果视为可靠，则进行下一步分析：将探针信号值和参考值相比较，如果探针信号值大于或等于该探针信号值的参考值，则判读为阳性；反之，则判读为阴性[20, 24-27]。

六、诊断标准

肺门、纵膈占位及淋巴结的恶性肿瘤诊断标准(符合以下条件之一即可确诊)： ①手术切除标本证实为恶性肿瘤； ②EBUS-TBNA标本中查见肿瘤细胞；③标本查见可疑肿瘤细胞，且与其他检查及临床特征相符合者(如：PET-CT高度怀疑恶性肿瘤、出现转移灶、抗肿瘤治疗后缓解等)[28-29]。

肺门、纵膈占位及淋巴结的结核诊断标准：(1)主要标准：①EBUS-TBNA或其他活检方法取得组织，经病理学检查证实为结核肉芽肿性病变；②和/或微生物学检查结果阳性；(2)次要标准：①临床表现、实验室检测及影像学特征等相符合；②除外其他肉芽肿性疾病；③抗结核治疗有效。确诊标准：①符合主要标准任何一条者；②符合两条以上次要标准者。

七、评价方法

恶性肿瘤以EBUS-TBNA穿刺组织病理学检查结果作为评价标准，恶性为阳性；如无明确恶性证据者，但在后续随访出现疾病变化及病理检查结果查见恶性证据者，也定性为阳性，并计算该方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确率。对于阴性患者然后依据病理结果不同，分别以查见结核性肉芽肿炎/肉芽肿坏死、查见类上皮细胞及坏死性炎，以及查见类上皮细胞及坏死性炎或者抽吸标本查荧光定量TB-PCR阳性等为依据，计算不同标准下纵隔淋巴结结核诊断准确率、敏感性及特异性。

结 果

所有患者均顺利完成了EBUS-TBNA手术，除轻微咳嗽、少量痰中带血、部分患者感觉轻微疼痛之外，无中重度手术并发症，取得的标本合格。经过3～6月随访，对所有研究对象进行最终诊断。4例失访而无法得到最终良恶性结果，因此纳入最终统计65例。

一、EBUS-TBNA对恶性肿瘤的诊断率

据EBUS-TBNA穿刺组织病理结果，恶性肿瘤27例，其中小细胞癌6例，腺癌8例，神经内分泌癌1例，鳞癌3例，肾癌肺转移1例，肺上沟瘤1例，未分类恶性肿瘤7例；非肿瘤38例。在这38例非肿瘤患者中，通过后期随访疾病变化情况及病理，有4例确诊为恶性肿瘤。故最终所有研究对象中肿瘤患者共31例，非肿瘤患者34例。

经统计得出，EBUS-TBNA诊断肺门、纵隔占位及淋巴结的恶性肿瘤敏感性为87.1% (27/31)。特异性为100%(34/34)、准确率为93.8%(61/65)，见表1。

二、EBUS-TBNA对纵隔淋巴结结核的诊断率

在34例非肿瘤病例中，通过细菌学检查、治疗并随访半年，最终确定：结核19例，尘肺1例，结节病7例，非结核分枝杆菌病2例，毛霉菌病1例，纵隔淋巴结囊肿1例，支气管淀粉样变性1例，淋巴结炎2例。

(1)若以EBUS-TBNA抽吸标本中病理查见结核性肉芽肿炎/肉芽肿坏死作为诊断结核的标准，其敏感性为68.7%(11/16)、特异性为78.9%(15/19)、准确率为74.3%(26/35)，见表2。

(2)若将病理结果解读的范围放宽，以“查见类上皮细胞、坏死性炎”作为诊断结核的标准，其敏感性为75%(15/20)、特异性为83.3%(15/18)、准确率为78.9%(30/38)，见表3。

(3)以TBNA病理结果以“查见类上皮细胞、坏死性炎”或者抽吸标本查荧光定量TB-PCR阳性为诊断结核的标准，其敏感性为90.5%(19/21)、特异性为100%(15/15)、准确率为94.4%(34/36)，见表4。

讨 论

10年前纵隔病变的诊断需要借助外科纵隔镜手术，创伤大、风险高，而EBUS-TBNA 针吸活检术具有可视、可控、安全、准确的优点，是一种超声和呼吸介入相结合的微创技术，可用于纵隔病变的诊断以及肺癌的分期。我国在2008年引入该技术，目前在三甲医院已经广泛开展，基本已取代了纵隔镜。查阅国内外多项研究论文发现，该技术诊断准确率差异较大，其敏感性与操作者的经验水平密切相关。

表1 EBUS-TBNA对恶性肿瘤的诊断率

表2 EBUS-TBNA结核的诊断率(以病理查见结核性肉芽肿炎/肉芽肿坏死为诊断标准)

表3 EBUS-TBNA对结核的诊断率(以病理查见类上皮细胞、坏死性炎为诊断标准)

表4 EBUS-TBNA结核的诊断率(以病理查见类上皮细胞、坏死性炎或TB-PCR阳性为诊断标准)

EBUS-TBNA在肺癌分期中的应用状况如何？2009年有研究者回顾分析了11项关于EBUS-TBNA在肺癌分期当中的应用[13, 19, 26]，共纳入1 299例患者，统计分析出其诊断肿瘤的总敏感性约93%，特异性100%。本项研究结果显示，EBUS-TBNA 诊断纵膈、肺门肿瘤的敏感性为87.1%，特异性为100%，准确率为93.8%，与既往研究结果基本相当。 但既往文献显示EBUS-TBNA在纵隔结核诊断的敏感性、特异性、准确率方面，各医疗机构的数据存在较大差异：Hassan等[21]报告，其敏感性 95%，特异性 100%，阳性预测价值100%，阴性预测价值80%。而Navani等[23]发现其敏感性为94%，其中84%的患者标本的细胞形态学查见结核性肉芽肿性炎，47%的患者标本的结核分枝杆菌培养阳性，但由于结核分枝杆菌的培养周期较长，约为3～84 d，平均16 d，所以患者的住院时间和费用会随之增加。Senturk等[24]也研究显示，EBUS-TBNA 标本进行TB-PCR诊断胸腔内结核的敏感性为56.7%，特异性为100%。Eom等[25]报告EBUS-TBNA标本进行DNA微阵列芯片法诊断胸腔内结核的敏感性为56%，特异性为100%(小样本研究)。王业等[26]报告通过EBUS-TBNA的组织标本形态学(查见结核性肉芽肿性炎)诊断结核的敏感性、特异性和准确率分别为65%、97.2%和89.9%。上述研究显示，EBUS-TBNA在纵隔结核的敏感性和特异性上差异较大(56.7%～95%)，详细阅读文献后发现差异的主要原因在于：①纵隔结核的病理金标准描述为“类上皮细胞、多核巨细胞灶状增生、干酪样坏死、肉芽肿形成”，但国内病理机构水平差别很大，或病理医生的谨慎程度不一，比如我院病理中心在判断“纵膈结核”时，病理报告极少出现“干酪性坏死、多核巨细胞、慢性肉芽肿”的典型结核肉芽肿描述，多数是以“纤维结缔组织、多核巨细胞、坏死组织、慢性肉芽肿”来进行病理描述，因此容易造成结核的诊断难以确认；②结核病、非结核分枝杆菌病、结节病在病理上很难区分；③关于结核分枝杆菌的检验方法、试剂不统一，差异性较大。建议在以后的临床工作中，加强临床医生和病理科医生的沟通，在结核病的诊治指南上病理金标准还需细化。

关于结核的各种辅助诊断方法有很多，常用的有AFB检测、结核抗体检测、结核特异性的 IFN-γ Elispot检测等，他们对于纵隔结核的诊断率都很低且缺乏特异性[30]。而EBUS-TBNA标本检测荧光定量TB-PCR(DNA微阵列芯片法)和FISH法测定结核分枝杆菌是新型快速生物检测方法，而且其在纵隔结核中应用的资料鲜有报道。

本文结果中19例结核患者中，仅有9例TBNA标本以DNA微阵列芯片法检出分枝杆菌，其中结核分枝杆菌6例、非结核分枝杆菌3例，说明穿刺标本中查见分枝杆菌的阳性率低于50%；但如果以EBUS-TBNA标本检测荧光定量TB-PCR联合病理检查，则可以将纵隔结核诊断敏感性提高到90.4%、特异性高达100%，说明两种方法联合使用可以大大提高诊断率，并缩短检验周期至3～5 d，而且该方法简单易行，并不增加手术时间和手术风险，所以值得临床推广应用。当然，我们研究样本量小，其代表性、可靠性还不够，后续仍需要扩大样本量深入研究。