HIF-1α、PD-L1与非小细胞肺癌淋巴转移的相关性

齐 倩 王春梅 杨 娟 田 英 冯 超

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常见的一类病理类型，其约占肺癌患者总数的85%，且发现时往往处于疾病中晚期，虽然近年来微创手术、放疗及免疫靶向治疗等手段的开展有效的提升了NSCLC的疗效，但此类患者远期存活率仍显著较低[1-2]。淋巴结转移是NSCLC患者病灶扩散的重要方式之一，研究指出，对未发生淋巴结转移的患者进行预测性评估淋巴结转移风险对于患者手术及治疗具有较好的指导意义[3-4]。Aguiar等[5]研究提出，程序性死亡分子配体(programmed death-ligand 1, PD-L1)是多个免疫细胞表面关键免疫检查点，其表达与NSCLC在治疗中发生免疫逃逸具有高度的相关性。上皮-间质转化作为NSCLC细胞侵袭转移重要影响因素，乏氧反应在其中扮演了很重要的角色，乏氧反应诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)则是介导乏氧反应的关键因素，其表达与NSCLC的侵袭及转移密切相关[6-8]。但目前国内关于HIF-1α、PD-L1表达水平与NSCLC患者术后淋巴转移风险的相关研究较少，为此我院对97例患者进行了一项前瞻性研究，报道如下。

资料与方法

一、临床资料

选择2015年12月至2017年12月于我院行肺叶切除术且未发生淋巴结转移的NSCLC患者97例。纳入标准：①所有患者均符合《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》中对于NSCLC的诊断标准[9]；②病例资料完整；③于我院行肺叶切除术且术后病理检查提示无淋巴结转移和切缘阳性。排除标准：①合并其他类型肿瘤；②严重的器官功能障碍；③抗肿瘤治疗史；④合并其他肺部疾病。与患者及家属签订知情同意书后纳入研究。所有患者年龄范围45～78岁，平均年龄(56.08±11.27)岁；平均病程(1.34±0.79)个月；TMN分期Ⅰ期44例、Ⅱ期53例；腺癌69例，非腺癌28例。

二、研究方法

1. 病灶组织固定切片： 对术中切除的病灶组织进行甲醛固定后使用石蜡包埋，并按照厚度5 μm进行连续切片备用。

2. 免疫组化染色： 对术中完成的切片进行脱蜡并使用蒸馏水反复冲洗直至切片洁净，使用山羊血清封闭室温下30 min对切片进行抗原修复，而后不同样本分别滴加HIF-1α及PD-L1单抗共同孵育，滴加单抗后样本于室温下放置30 min后放入4 ℃环境中保存过夜，次日将样本取出并于室温下放置50 min复温，而后磷酸盐PBS进行反复冲洗3次，分别滴加HIF-1α及PD-L1二抗，室温下共同孵育30 min后使用PBS再次进行冲洗3次(5 min/次)，彻底清洁切片周围液体后滴加显色剂DAB工作液于室温下孵育5～10 min后使用蒸馏水冲洗3次，二手使用苏木素进行复染，随后对切片进行分化(盐酸乙醇)及反蓝(饱和碳酸锂)处理，蒸馏水充分冲洗后对切片进行脱水(95%乙醇)、透明处理(二甲苯)，并使用中性树胶封片。

三、观察指标

影像学检查、术中病理检查符合《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》中对于肺癌淋巴结转移的判定标准[9]。采用半定量法，HIF-1α及PD-L1表达水平=染色阳性细胞数比例等级×染色强度等级[10]。①染色阳性细胞数比例判断方法：于400倍镜下选择10个视野，观察每个视野计数的100个细胞中的阳性细胞数占比；②染色阳性细胞数比例等级判定标准：共分为4级，其中0级：阳性细胞<10%；1级：阳性细胞10%～25%；2级：阳性细胞26%～50%，3级：51%～75%；4级：76%～100%[11]；③染色强度判断标准 0级：无着色；1级：浅棕色；2级：棕色；3级：深棕色[12]。表达水平<6为低表达，≥6为高表达。

分析所有患者中统计随访结束时所有患者淋巴转移情况，比较转移及未转移患者临床资料[包括：年龄、性别构成、BMI、TMN分期、病理分型、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)表达水平]、影像学资料(包括：肿瘤直径、影像学特征、病灶位置)之间的差异。分析根据HIF-1α、PD-L1对淋巴结转移判定标准将所有患者根据两种蛋白的表达量分别分为高表达和低表达组，并比较二组之间淋巴转移情况之间的差异。

从患者出院开始进行为期24个月的随访，主要通过电话及患者来院复查随访，CT复查按照《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》的标准，如随访期间患者自觉病情变化可随时到院进行检查[9]。

四、统计学方法

结 果

一、纳入研究患者的随访情况

截止2019年12月31日随访结束，92例患者完成随访，5例失访，中位随访时间为22(14，24)个月；共发生淋巴结转移例数36例，淋巴结转移率39.13%。

二、HIF-1α、PD-L1表达量对NSCLC患者淋巴结转移的影响

按照 HIF-1α、PD-L1表达量将所有完成随访的患者进行分组，HIF-1α高表达(n=27)，低表达(n=65)，患者的淋巴结转移发生率分别为92.6%和26.9%，HIF-1α高表达的NSCLC患者淋巴结转移率显著高于低表达患者(log-rankχ2=63.052；P<0.001)。PD-L1高表达(n=28)和低表达(n=64)的淋巴结转移发生率分别为82.1%和21.3%，PD-L1高表达的NSCLC患者淋巴结转移率显著高于低表达患者(log-rankχ2=39.555；P<0.001)，具体见图1，2。

图1 HIF-1α表达量对于NSCLC患者淋巴结转移的影响

图2 PD-L1表达量对于NSCLC患者淋巴结转移的影响

三、NSCLC患者淋巴结转移的影响因素Cox单因素分析

单因素Cox分析结果显示， HIF-1α、PD-L1表达量、TMN分期、CEA、肿瘤直径是NSCLC患者淋巴转移的影响因素(P<0.05)，见表1。

表1 NSCLC患者淋巴结转移的影响因素分析

表2 影响淋巴结转移的Cox回归分析结果

四、NSCLC患者淋巴结转移的影响因素Cox回归分析

根据单因素分析结果，以随访结束发生淋巴结转移为因变量(1=是，0=否)；以 HIF-1α、PD-L1表达量(1=高表达，0=低表达)TMN分期(1=Ⅱ期，0=Ⅰ期)，CEA(实测值)及肿瘤直径(实测值)为自变量；发生淋巴结转移时间为时间轴进行Cox回归分析，结果显示， HIF-1α高表达(HR=25.790,95%CI=10.005-30.287)、PD-L1高表达(HR=16.693，95%CI=12.014-20.356)、CEA(HR=1.058，95%CI=1.013-1.106)是NSCLC患者淋巴转移的危险因素(P<0.05)，见表2。

讨 论

淋巴转移是导致NSCLC患者疾病进展的关键因素，对于临床治疗效果、远期生存率也有显著的影响[13-14]。手术治疗是目前多个指南中对于早期NSCLC患者必要治疗方式，但对于术中淋巴结清扫及范围的选择在指南中仍需要主刀医生进行术中判断，通过早期检测并结合影像学证据可以为医生选择手术方式提供较好的参考，同时也为后期治疗方案的优化提供一定的帮助[15-16]。

以往研究显示，HIF-1是体内参与低氧代谢下细胞型号传导的DNA结合型蛋白，而其中的α亚体被低氧状态诱导激活，控制HIF-1的活性并调节其表达状态[17-18]。PD-L1则是介导机体免疫反应的重要因素，与PD-1结合后可通过ITSM募集SHP-2蛋白，促使T细胞抗原受体信号通路多个关键分子发生磷酸化，抑制T细胞的增殖及活性，PD-L1在肿瘤细胞表面表达是导致肿瘤细胞发生免疫逃逸的重要因素[19-20]。Zhao等[21]研究指出，EZH2抑制剂可以通过降低HIF-1α来抑制PD-L1的表达，说明二者与NSCLC的发生发展具有密切关系。本文结果提示，NSCLC患者病灶内的 HIF-1α、PD-L1表达量与其远期发生淋巴结转移的风险具有显著的相关性。Samulitis等[22]研究提出，正常细胞中HIF-1α半衰期较短，而肿瘤细胞在快速大量的增殖过程中往往处于相对缺氧状态，故HIF-1α极易被激活并维持较高的表达水平。由此可以认为，当NSCLC患者瘤细胞处于快速增殖状态时HIF-1α会高表达，而快速增殖状态的癌细胞也更容易发生淋巴结转移。正常人体内活化PD-L1表达的信号通路相对较多，已经被证实的有ALK/STAT3、PI3K、IFN-γ/JAK2/IFN及MEK/ ERK/STAT1四个通路，而上述通路中多个关键蛋白，如STAT3、PI3K及IFN-γ等均与NSCLC的发生和发展具有密切关系，故上述通路在诱导NSCLC细胞增殖的同时，还能激活细胞表面的PD-L1表达，降低免疫系统的抗癌反应，从而导致癌细胞扩散，并发生淋巴结转移[23-25]。

研究指出CT对于淋巴结微小转移的判断并无显著优势，而且由于早期NSCLC患者淋巴结癌转移灶增大不显著，通过影像学特征判断可能与炎性或肉芽肿性病灶混淆从而导致误诊的情况发生，这也充分说明了影像学检测在判断NSCLC患者淋巴结转移上的局限性[26-27]。本文显示，HIF-1α、PD-L1表达量及CEA水平是影响淋巴结转移的危险因素，此结果再次说明了HIF-1α、PD-L1表达量对于NSCLC患者淋巴结转移的相关性。而Tomita等[28]研究显示，CEA对于NSCLC患者淋巴结转移具有一定预测及判定价值，而且CEA对NSCLC的影响力受到肿瘤直径的影响，这与本文研究结果类似。虽然根据肺癌TMN分期标准，肿瘤直径是判定患者TMN分期的重要因素，同时多个研究结果显示，分期较高的患者癌细胞的侵袭及转移性也相对较高，故发生淋巴结转移的可能性也较大[29-30]，但本文中多数患者为早期，肿瘤直径也相对较小，由于其他因素的共同作用将TMN分期和直径对淋巴结转移的影响抵消，同时本文为单中心小样本量研究，结果可能存在一定偏倚，这也可能成为导致结果出现差异的原因。

综上，HIF-1α、PD-L1表达量与NSCLC患者发生淋巴转移风险存在显著相关行，对于NSCLC患者淋巴结转移具有预测价值，有助于NSCLC患者疾病进展的防治。