斑马鱼功效模型在验证乳制品补钙和促进肠蠕动中的应用

蒋一之，朱晓宇，李露露,，俞航萍，荣佳，李春启,,3*

(1. 南京新环检测科技有限公司，南京 210032； 2. 杭州环特生物科技股份有限公司， 杭州 310051；3. 浙江省人用物品安全性评价技术研究重点实验室早期评价基地， 杭州 310053)

随着经济的发展，乳制品市场的逐渐扩大，牛奶和酸奶成为了非常受欢迎的饮品。消费者在选择牛奶和酸奶品质除去口味营养，还会关注牛奶的补钙和酸奶促进肠胃蠕动这两方面。因此评价牛奶和酸奶的品质有必要引入生物学评价，通过生物指标能直观反映产品的营养等品质。

斑马鱼是一种新型的实验动物，与传统小鼠相比，斑马鱼实验速度快、高效、低成本[1]。斑马鱼体积小，发育快，且和人类具有高度同源性，有相似的器官、生理功能和信号通路[2-3]。斑马鱼生物学评价能够完善现有的食品检测技术和品质评价体系方法，为优质产品的筛选和评价提供了一种新方法。

钙黄绿素是一种荧光染料，与体内钙离子结合[4]，而骨骼主要是有钙化结构组成[5]，可用于检测斑马鱼骨骼钙水平。同样是荧光染料尼罗红在斑马鱼体内不被其他组织干扰，并不会被吸收[6]，通过定量斑马鱼胃肠道内的尼罗红可评价促肠蠕动作用。本研究以斑马鱼前3根椎骨的荧光强度和肠道内尼罗红的荧光强度为指标，快速评价纯牛奶补钙和酸奶促进肠道蠕动功能，为牛奶和酸奶品质的生物学评价提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验用斑马鱼为野生型AB品系斑马鱼，胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。胚胎置于标准稀释水中(标准稀释水：294.0 mg/L CaCl2·2H2O、123.3 mg/L MgSO4·7H2O、63.0 mg/L NaHCO3和5.5 mg/L KCl)，在28℃ 条件下孵化。本研究实验单位杭州环特生物科技股份有限公司已获得实验动物使用许可证【SYXK(浙)2012-0171】，并通过国际AAALAC认证(001458)。

1.1.2 试剂与仪器

甲基纤维素(079K0054 V， Sigma)；6孔板(090119BA01，Nest)；尼罗红Nile Red(N3013-100MG，Sigma)；钙黄绿素(MKCH3930， Sigma)；DMSO(BCBT0803，Sigma)；A、B两个品牌的纯牛奶(A0、A1、A2、B0、B1和B2，其中A0和B0为普通纯牛奶，A1和B1为高钙牛奶，A2和B2为高端纯牛奶)、酸奶(A3、A5、A6、B3、B5和B6)和乳酸菌饮料(A4和B4)(购于世纪联华江晖路店，杭州)；荧光显微镜(AZ100，Nikon)；与显微镜相连的相机(TK-C1481EC，Nikon)；精密电子天平(cp214，OHAUS)。

1.2 方法

1.2.1 纯牛奶LC10、LC50和最大耐受浓度(maximum tolerable concentration，MTC)测定

随机选取930尾发育健康且阶段一致的3 dpf斑马鱼于六孔板中，每孔30尾。分别加入浓度为10、14.3、20.1、28.4和40 mg/mL的6种牛奶稀释液(标准稀释水稀释)，每孔3 mL，每天换液，处理96 h，同时设置正常对照组(标准稀释水处理组)。实验结束后，统计各实验组斑马鱼死亡数量，用OriginPro 8软件拟合，计算LC10、LC50和MTC。

1.2.2 牛奶补钙效果评价

随机选取570尾发育健康且阶段一致的3 dpf的野生型斑马鱼于6孔微孔板中，每孔30尾，分别暴露于MTC/4、MTC/2和MTC的6种纯牛奶稀释液中，同时设置正常对照组；样品处理斑马鱼至7 dpf，使用2 mg/mL钙黄绿素染色。染色后，每实验组随机选择10尾斑马鱼，在显微镜下拍照并采集数据，计算斑马鱼前3根椎骨的荧光强度(S)，补钙作用的计算公式如下：

1.2.3 酸奶和乳酸菌饮料MTC测定

随机选取1230尾发育健康且阶段一致的6 dpf斑马鱼于六孔板中，每孔30尾。分别加入浓度为10、14.3、20.1、28.4和40 mg/mL的8种酸奶稀释液，每孔3 mL，处理24 h，同时设置正常对照组。实验结束后，统计各斑马鱼死亡数，用OriginPro 8软件拟合，计算LC10、LC50和MTC。

1.2.4 酸奶和乳酸菌饮料对肠蠕动的促进作用评价

随机选取750尾受精后5 d(5 dpf)的野生型AB品系斑马鱼，水溶给予尼罗红16 h建立斑马鱼胃肠动力促进剂筛选模型。尼罗红移除后，将斑马鱼随机分配于六孔板中，每孔30尾。分别暴露于MTC/4、MTC/2和MTC的8种酸奶稀释液中，同时设置正常对照组。处理24 h后，每实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，计算斑马鱼肠道内尼罗红荧光强度(S)，肠蠕动的促进作用计算公式如下：

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 纯牛奶的LC10、LC50和最大耐受浓度(MTC)测定

6种纯牛奶的MTC均为10 mg/mL。通过拟合的浓度-致死曲线得到6种纯牛奶的相应浓度都很相近，LC10为12.9 ～ 14.5 mg/mL，LC50为19.9 ～ 21.2 mg/mL。详见表1。

2.2 纯牛奶补钙功能评价

A0和A2在10.0 mg/mL浓度下分别引起斑马鱼骨骼中钙显著增加1.39倍(P< 0.05)和1.47倍(P< 0.01)，和空白对照组有显著性差异。其他种类和浓度的纯牛奶未引起骨骼钙的显著增加(P> 0.05)。详见表2、图1、图2和图3。

表1 6种纯牛奶的LC10、LC50和MTC(n=30)Table 1 LC10, LC50 and MTC of 6 kinds of UHT milk (n=30)

表2 6种纯牛奶补钙评价结果(n=30)Table 2 Evaluation results of calcium supplementation of 6 kinds of UHT milk (n=30)

注：与空白对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。下表/图同。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. The same in the following tables and figures.

图1 6种纯牛奶处理斑马鱼后各组斑马鱼脊椎骨荧光强度总和Figure 1 Total fluorescence intensity of vertebrae of zebrafish in each group after treatment with 6 kinds of UHT milk

图2 6种纯牛奶处理斑马鱼后各组斑马鱼骨骼中钙增加倍数Figure 2 Increase of calcium in zebrafish bones of each group after 6 UHT milk treatments

图3 6种纯牛奶处理斑马鱼后最高浓度组斑马鱼骨骼中荧光强度对比Figure 3 Comparison of fluorescence intensity in the bones of zebrafish treated with 6 kinds of UHT milk at the highest concentration

2.3 酸奶和乳酸菌饮料的LC10、LC50和MTC测定

8种酸奶和乳酸菌饮料的MTC均为10 mg/mL。通过拟合的浓度-致死曲线得到酸奶和乳酸菌饮料的相应浓度都很相近，LC10为12.7 ～ 15.6 mg/mL，LC50为18.9 ～ 21.1 mg/mL。详见表3。

2.4 酸奶和乳酸菌饮料对肠蠕动促进作用评价

实验组斑马鱼的肠道荧光信号强度平均值均显著低于空白对照组(P> 0.05)，说明酸奶和乳酸菌饮料均促进斑马鱼肠道蠕动。A3和B3为常温酸奶，A4和B4为冷藏乳酸菌饮料，这两组内不同品牌同类酸奶和乳酸菌饮料对肠蠕动的促进作用没有显著性的差异(P> 0.05)。A5、B5、A6和B6四种冷藏酸奶中，A5、B5和B6三种酸奶间肠蠕动促进作用不存在显著性差异(P> 0.05)，但是作用都显著优于A6酸奶(P< 0.001)。同品牌内不同酸奶和乳酸菌饮料促进肠蠕动作用存在差异，A5 > A3 > A6 > A4，B5 > B3 > B6 > B4，两款常温酸奶作用都介于同品牌的两种冷藏酸奶中间；两款乳酸菌饮料的作用均显著差于酸奶(P< 0.001)。(见表4,图4、5、6)

表3 8种酸奶和乳酸菌饮料的LC10、LC50和MTC(n=30)Table 3 LC10, LC50 and MTC of 8 kinds of yogurt and lactobacillus beverage (n=30)

图4 8种酸奶和乳酸菌饮料处理斑马鱼后各组斑马鱼肠道荧光信号强度Figure 4 Intestinal fluorescent signal intensity of zebrafish in each group after treatment with 8 yoghurt and lactobacillus beverage

表4 8种酸奶和乳酸菌饮料肠蠕动促进作用评价实验结果(n=30)Table 4 Evaluation results of 8 kinds of yogurt and lactobacillus beverage for promoting intestinal peristalsis (n=30)

图5 酸奶和乳酸菌饮料处理后斑马鱼肠道内荧光强度变化Figure 5 Changes of intestinal fluorescence intensity of zebrafish treated with yoghurt and lactobacillus beverage

图6 8种酸奶和乳酸菌饮料对斑马鱼肠道肠蠕动的促进作用Figure 6 Effects of 8 kinds of yoghurt and lactobacillus beverage on intestinal peristalsis of zebrafish

3 讨论

牛奶中钙的存在形式主要是乳钙，其主要成分是磷酸钙[7]。乳钙被认为是容易消化吸收并且营养价值最好的钙来源[8-9]。普通纯牛奶和高端纯牛奶在加工过程中没有添加其它物质，钙全部来源于生牛乳，而高钙牛奶中的乳钙因为添加的碳酸钙等破坏了原有的平衡而析出[10-11]，虽总体钙含量增加，但吸收利用度高的乳钙减少，可能高钙牛奶的补钙效率并没有优于普通纯牛奶。

研究表明酸奶和乳酸菌饮料具有促进肠道蠕动的作用[12-15]，与本次实验的结果相同，所有酸奶和乳酸菌饮料均有促进了肠道蠕动作用，但酸奶明显优于乳酸菌饮料，且活菌数量很少的常温酸奶和冷藏酸奶作用相近。用于酸奶和乳酸菌饮料加工的双歧杆菌、乳酸菌等菌种属于肠道有益菌，有益菌和其代谢产物都能改善肠道功能，促进肠道蠕动[16]。

实验对纯牛奶补钙以及酸奶和乳酸菌饮料促进肠蠕动两方面进行了生物学评价，结果与一般消费者的想法存在差别，但是同时是能够指导消费者进行正确选择。不同纯牛奶、酸奶和乳酸菌饮料作用的差别只进行了简短的讨论，需要后续实验进行更深入的研究。