烟草秸秆中产纤维素酶细菌筛选、鉴定及酶活测定

李正风，朱 杰，唐 丽，董高峰，吴 涛，廖头根，张 伟，夏玉珍，王奕权，李 岩

(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231；2.红塔烟草(集团)有限责任公司，云南 玉溪 653100；3.北京微普联合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意义】纤维素是地球上储量最丰富的可再生性能源物质，全球植物每年新和成纤维素产物达29亿t左右[1]，中国每年秸秆类纤维素产量达7亿t[2]。大量的秸秆被焚烧或丢弃造成资源浪费[3]，秸秆类物质是生态有机质资源，腐熟还田能增加土壤有机质含量、改善土壤质量、减轻长期施加化肥对土壤的影响、提高农作物产量和品质[4]。云南是中国烟草的主产区，每年烟叶收获后产生大量的废弃秸秆，这些秸秆的随意堆放及丢弃不仅会影响环境而且容易引发火灾。【前人研究进展】研究显示，不同作物的秸秆还田能提高土壤团聚体稳定性[5]，改良植烟土壤且利于提高烟草品质。产纤维素酶菌株的应用能提高秸秆类物质的腐熟效率[6]，缩短发酵周期，加快秸秆还田效率。【本研究的切入点】从云南烟草秸秆自然腐熟物中选择性分离产纤维素酶菌株，对菌株进行初筛选定部分酶活较高的菌株进行分子生物学鉴定，通过复筛确定高效菌株，并对产纤维素酶条件进行优化。【拟解决的关键问题】为促进烟草秸秆堆肥还田提供了优良种质资源，所筛选的高效菌株和优化的产酶条件将利于纤维素酶的纯酶产品开发。

1 材料与方法

1.1 材料采集

样品取自云南曲靖、弥勒烟草秸秆自然堆肥样品。

1.2 产纤维素酶菌株分离

称取堆肥样品1 g于10 mL灭菌生理盐水(0.85 %)中，28 ℃摇床，200 r/min震荡10 min，分别梯度稀释10-1～10-8，并分别取100 μl涂布于分离培养基(羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、琼脂15 g、蒸馏水 1000 mL)上。28℃倒置培养5～7 d。分别挑取单菌落至羧甲基纤维素钠培养基反复划线纯化，直至纯化。并分别保藏至20 %甘油中，-80 ℃冷冻保藏。

1.3 产纤维素酶菌的初筛

将纯化后的菌株点接在羧甲基纤维素钠平板上，28 ℃倒置培养5 d，测定菌落直径(D)，在平板上加入刚果红染液(1 g/L)没过菌落，常温1 h后弃染液，加入NaCl溶液(0.06 %，w/v)，冲洗3～5次，向平板中加入足量的NaCl溶液1 h，测定透明圈直径(H)，计算H/C值。

1.4 产纤维素细菌鉴定

将初筛中能形成水解圈的菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15～25 g、蒸馏水 1000 mL，pH 7.4～7.6)中，28 ℃、200 r/min培养至OD=0.8，分别取1 mL菌液，12 000 r/min离心2 min，弃上清，用天根细菌基因组提取试剂盒提取总DNA，用Nano Drop OD 2000C检测DNA浓度和纯度，-20 ℃保存备用。分别以菌株基因组总DNA为模板，用细菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R[7]扩增16S rRNA基因序列，电泳检测合格后送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。分别将序列通过GenBank比对并选取参考序列，用MEGA 7.0[8]构建系统发育树，并根据系统关系确定分类地位。

1.5 纤维素酶活力测定

1.5.1 粗酶液制备 分别将待测菌株接种至15 mL发酵培养基(羧甲基纤维素钠5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸馏水 l 000 mL)中，28 ℃、220 r/min振荡培养3～4 d，6000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.5.2 纤维素酶活力测定 (1)葡萄糖标准曲线绘制:配制1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作为标准葡萄糖母液，将母液分别稀释为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的葡萄糖溶液于5 mL离心管中，分别取2 mL，并分别加入1mL DNS溶液(酒石酸钾钠182 g、3,5-二硝基水杨酸6.3 g、NaOH 21 g、苯酚 5 g、亚硫酸钠5 g、蒸馏水1000 mL)，沸水浴煮沸10 min，冷却，补加21.5 mL蒸馏水。分别在波长540 nm用分光光度计测定吸光值，并绘制葡萄糖标准曲线。

(2)菌株纤维素酶活力测定:滤纸酶活测定:将新华1号滤纸剪成1 cm×3 cm的小条，卷成小卷后置5 mL 试管内，分别加入醋酸-醋酸钠缓冲液(pH = 4.8) 1.75和0.25 mL酶液，摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中，将试管置于50 ℃水浴1 h，加入1 mL DNS试剂，沸水浴10 min后置冷水中冷却。用酶标仪测定吸光度值，波长为540 nm。内切酶酶活测定:取含有0.5 %羧甲基纤维素钠的醋酸缓冲液1.75 mL加入5 mL 试管中，加入酶液0.25 mL，将EP管放入50 ℃水浴0.5 h，加入1 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷水冷却。用酶标仪测定吸光度值，波长为540 nm。外切酶酶活测定:取含有0.5 %微晶纤维素的醋酸缓冲液1.75 mL加入5 mL试管中，加入酶液0.25 mL，于50 ℃水浴2 h后，加入1 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷水冷却。用酶标仪测定吸光度值，波长为540 nm。

(3)酶活力计算:酶活力定义：在50 ℃条件下，1 mL粗酶液在1 min内水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量为1个纤维素酶酶活力单位(U/mL)[9-11]。

1.6 高效菌株发酵条件的优化

1.6.1 培养基pH对产酶的影响 分别配制pH为4、5、6、7、8、9的羧甲基纤维素钠液体培养基，分别接种高效菌株，于28 ℃、200 r/min培养3 d后测定纤维素酶活力，确定最佳pH。

1.6.2 碳源对产酶的影响 配制最佳pH条件，含0.25 %、0.5 %、0.75 %、1.0 %、1.25 %羧甲基纤维素钠的羧甲基纤维素钠发酵培养基，分别接种高效菌株，于28 ℃、200 r/min培养3 d后测定纤维素酶活力，确定最佳碳源浓度。

表1 产纤维素酶菌株初筛结果Table 1 Primarily screening results for cellulase producing strains

表2 纤维素酶活力测定结果Table 2 Results of cellulase activity

1.6.3 氮源对产酶的影响 分别配制最佳pH条件、最佳羧甲基纤维素钠浓度、含0.25 %、0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %的NaNO3的羧甲基纤维素钠发酵培养基，分别接种高效菌株，于28 ℃、200 r/min培养3 d后测定纤维素酶活力，确定最佳氮源浓度。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶细菌的筛选鉴定

从分离平板上分别挑取不同形态的细菌及放线菌，根据单菌落大小、形态、颜色最终选定51株菌。经刚果红染色初筛，有15株细菌形态菌株、3株放线菌形态菌株产生透明水解圈。其中9株菌的水解圈最明显(表1)。透明圈直径/菌落直径最大的是菌株L43和zy004，比值达4.0。虽然透明圈直径/菌落直径比值直接反映了酶浓度的高低，但其不能作为菌株酶活的唯一定量指标，所以有必要对这些菌株进一步进行产酶酶活测定。

2.2 纤维素酶活力测定结果

葡萄糖标准曲线如图1所示，根据标准曲线构建了线性回归方程。对在羧甲基纤维素钠培养基上有较大水解圈的菌株分别测定滤纸酶活、内切酶酶活、外切酶酶活，结果如表2所示。其中菌株L43的滤纸酶活最高，达8.53 U/mL，其外切酶酶活最高，达20.17 U/mL。综合初筛和酶活测定结果，菌株L43的纤维素酶活力最高。

2.3 产纤维素酶菌株系统发育地位确定

分别扩增并测定了9株产纤维素酶菌株的16S rRNA基因序列，并分别在GenBank中比对以获取同源序列。从系统发育树(图2)和相似性分析表明，zy001与StenotrophomonaspavaniiLMG 25348T相似性最高99.9 %，命名为Stenotrophomonassp. zy001；zy002与PantoeadispersaDSM 30073T相似性最高99.6 %，命名为Pantoeasp. zy002；zy003与EnterobacterludwigiiEN-119T相似性最高为99.9 %，命名为Enterobactersp. zy003，zy004与NovosphingobiumgossypiiJM-1396T相似性最高为99.6 %，命名为Novosphingobiumsp. zy004，zy005与StreptomycesalbolongusNBRC 13465T相似性最高为99.9 %，命名为Streptomycessp. zy005；zy006与StreptomycesdiastaticusNBRC 15402T相似性最高为99.9 %，命名为Streptomycessp. zy006；zy007与PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高为98.4 %，命名为Pseudomonassp. zy007；zy008与PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高为99.9 %，命名为Pseudomonassp. zy008；L43与LuteibacterrhizovicinusLJ96T相似性最高为97.5 %，命名为Luteibactersp. L43。9株纤维素酶活力较高的菌株属于7个属，其中L43与参考菌株相似性最低，是该属的一个潜在新种。

图1 DNS比色法测定葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose based on DNS colorimetric method

图2 根据16S rRNA构建的产纤维素酶菌株的系统发育树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of cellulase producing bacteria

图3 pH对纤维素酶的影响Fig.3 The effect of pH on cellulase

2.4 高效菌株L43发酵条件优化

这9株产纤维素酶较高的菌中，L43酶活最高，所以选择该菌进行发酵产酶条件优化。如图3所示，pH对该菌的纤维素酶活力有一定影响，在pH 6的发酵培养基中纤维素酶酶活最高。

如图4所示，在pH 6的发酵培养基中当羧甲基纤维素钠为1.25 %时，纤维素酶活力最高。

配制pH 6、羧甲基纤维素钠为1.25 %的不同氮源(NaNO3)浓度的发酵培养基，酶活测定表明在羧甲基纤维素钠为0.5 %时纤维素酶活力最高(图5)。在发酵培养基pH 6、羧甲基纤维素钠浓度为1.25 %、NaNO3浓度为0.5 %时纤维素酶活力最高，滤纸酶活达(16.9±1.61)U/mL，外切酶酶活达(39.62±1.65)U/mL。

图4 碳源浓度对L43纤维素酶的影响Fig.4 The effect of carbon source concentration on cellulase

图5 氮源浓度对L43纤维素酶的影响Fig.5 The effect of nitrogen source concentration on cellulase

3 讨 论

本实验用羧甲基纤维素钠培养基从自然发酵的烟草秸秆堆肥腐熟物中选择性分离出能产纤维素酶的51株菌，从形态上分为细菌及放线菌。经过刚果红染色初筛，筛选到9株透明圈较大、产纤维素酶活力较高的菌株。经16S rRNA序列分析将这些菌为7个属。其中纤维素酶活力最高的菌株L43与参考菌株L.rhizovicinusLJ96T相似性较低，为Luteibacter的潜在新种。通过单因素试验明确发酵培养基的pH、碳源浓度、氮源浓度对纤维素酶活力的影响，并筛选出最优的发酵培养基：羧甲基纤维素钠12.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO35 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸馏水 l 000 mL、pH 6。其最高酶活为滤纸酶活：16.9 U/mL，外切酶酶活：39.62 U/mL，培养基优化后滤纸酶活提高了，所分离的产纤维素酶活力较高的细菌及放线菌的外切酶酶活较高，但所有菌株的内切酶酶活较低。试验结果为高效菌株L43的纤维素酶利用提供了理论基础。

产纤维素酶菌株在自然界中分布广泛，作为纤维素生物质的分解者，在自然界中植物秸秆降解物质循环中发挥重要的作用，从烟草秸秆中分离出多种产纤维素酶菌株，为烟草秸秆还田提供了优良的菌株资源。Stenotrophomonas[12]、Pseudomonas[12-13]、Pantoea[14-15]、Enterobacter[13,16]、Novosphingobium[17]、Streptomyces[13]等属的菌株有纤维素降解活性，也有相关报道。但Luteibacter菌株的报道并不多，目前该属有效发表的种有3个，其中Luteibacterrhizovicinus分离自大麦根际[18]，从三尖杉根际分离的Luteibactersp.对三尖杉宁碱具有转化作用[19]，从西沙野生诺尼果成熟果实中也分离到Luteibacter属的菌株[20]。因此，Luteibacter属的菌在自然界与植物会有一定的互作关系。有关Luteibacter菌具产纤维素酶活性是首次报道，提供了新的产纤维素酶菌株资源。不同微生物有着不同降解效率[21]，多种菌互作能更有效降解纤维素[22]，因此要重视和加强对多种产纤维素酶菌提高烟草秸秆腐熟的研究。若把混菌发酵技术应用到烟草秸秆堆肥中，将会有效提高烟草秸秆的腐熟效率，对烟草秸秆及其他农作物秸秆类资源的开发应用及环境保护具有重要的意义。

4 结 论

本研究为烟草秸秆腐熟提供了优良产纤维素酶菌株资源，为Luteibactersp. L43的开发利用奠定了基础。