山西桦褐孔菌的鉴定与固态发酵初步研究

李艳婷，徐莉娜，郭霄飞，朱 敏，南晓洁，李银生，郭 尚*

(1.山西省农业科学院 食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西省太原市阳曲县农业农村局，山西 太原 030100)

【研究意义】桦褐孔菌，Inonotusobliquus(Fr.)Pilat，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymeno-mycetes)、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、锈革菌科(Hymenochaetaceae)、褐卧孔菌属(Inonotus) (=纤孔菌属)，异名斜纤孔菌、斜生纤孔菌、桦癌孔菌、白桦茸、茶卡、和蔷甘等[1]。桦褐孔菌受到全世界的广泛关注是从1968年前苏联诺贝尔文学奖获得者Aleksandr Isayevich的小说《癌病房Rakovy Kovpus》而开始的[2]。近年来，桦褐孔菌作为一种珍贵药用真菌，因具有调节血糖血脂、抗肿瘤、抗氧化、调节、抗炎、保肝、调节免疫等作用[3]，逐渐引起越来越多国内学者的关注。【前人研究进展】桦褐孔菌主要分布在北半球北纬40°～50°的地区，如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯、日本等国家和地区[4-5]。在我国，桦褐孔菌主要分布在位于黑龙江、吉林和内蒙古自治区的大兴安岭、小兴安岭和长白山地区[6-11]。山西省农业科学院食用菌研究所郭尚劳模创新工作室在山西省方山县的关帝山(吕梁山南段)也发现有大量的桦褐孔菌分布，当地还成立有专门的公司进行桦褐孔菌的粗加工及销售。根据戴玉成和范宇光[12-13]的调查，桦褐孔菌在我国属于稀有和濒危类型。桦褐孔菌的野生资源匮乏，人工栽培虽有成功报道，但尚未实现规模化生产[14-18]。【本研究切入点】本文首次报道了山西桦褐孔菌的相关研究。通过对采自山西吕梁山南段的桦褐孔菌进行形态特征分析、分子生物学鉴定、品质鉴定，同时还选用了山西常见的小米、小麦、藜麦、黄豆、大豆、荞麦、燕麦、玉米、薏米和大米共十种杂粮谷物作为发酵基质，对采自山西的桦褐孔菌分离得到的菌丝体进行谷物固态发酵，并明确桦褐孔菌在这十种杂粮谷物中的发酵特点。【拟解决的关键问题】通过了解其生长特性以获得最优质的发酵产物，为这一特殊的野生资源的开发与利用提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株来源：本课题组在2017年10月于山西吕梁山脉的关帝山(北纬37.5°，东经111.2°)采集到桦褐孔菌，标本编号IOSF373816。将采集的桦褐孔菌菌核进行组织分离得到纯菌株，保存在山西省农业科学院食用菌研究所菌种库。

品质鉴定试剂：葡萄糖，Agar，酵母膏，HNO3，H2O2，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，元素标准溶液(1000 μg/L)，超纯水、蒸馏水、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、过硫酸钾等，均为分析化学纯。

固态发酵材料：山西产小米、小麦、黄豆、玉米、薏米、燕麦、藜麦、荞麦、大豆和大米，要求颗粒饱满、无杂质、无虫蛀。

1.2 试验方法

1.2.1 分离纯化 选取新鲜的桦褐孔菌菌核，去除表面杂质，75 %酒精清洗其外表面3 次，置于无菌烧杯中待用。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然[19]。采用组织分离法进行分离。在无菌条件下，切取5 mm×5 mm的菌核组织块接入装有PDA培养基的试管内，置于25 ℃[12]恒温箱中倒置培养。培养过程中主义观察，如有污染及时检出。待菌丝长满试管斜面后，置4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 形态鉴定与分子生物学鉴定 肉眼观察标本的颜色、质地、形状、生长年限、平伏或有菌盖，菌盖是否有毛或环带等特征，然后用标尺测量子实体的长度、宽度和厚度。

将纯菌株培养，CTAB法提取菌丝DNA；ITS片段进行PCR扩增。引物序列如下：ITS 1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )ITS 4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )。 PCR反应体系(25 μl)：10×PCR buffer 2.5 μl、TaqDNA 酶0.3 μl、Mg2+(25 mmol/L)2 μl、dNTP 0.3 μl、引物ITS 1/ITS 4各0.7 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 17.5 μl。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min；共35个循环。然后再经过PCR产物琼脂糖凝胶电泳、PCR产物的回收、PCR产物序列测定，用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI ribosomal RNA sequence(Bacteriaand Archaea)数据库中的数据进行比对，与待测菌种序列相似性最大的菌种，即为鉴定结果[20-21]。

1.2.3 品质鉴定 粗多糖：苯酚-硫酸法[22]；β-葡聚糖：GB5009.5-2010第一法[23]；抗氧化活性：粗多糖清除DPPH自由基能力[24]；粗蛋白：凯氏定氮法[25]；三萜类化合物：参照DB44/T 496-2008[25]；总黄酮：紫外分光光度法[26]；微量元素：ICP-AES法[27]。

1.2.4 固态发酵试验 ①谷物培养基制备。浸煮：所需谷物称量，去除杂物，浸煮各谷物，并捞出摊于地面上晾干(水分含量约40 %)。配料分装与灭菌：将浸煮好的谷物分装至玻璃瓶中，每瓶湿重约150 g，121 ℃高压灭菌2 h。 ②接种。灭菌的谷物培养基放凉后，按无菌操作要求，挑取带PDA培养基的的斜面菌种(0.5 cm×0.5 cm)，接至谷物培养基中央。③培养与观察。 25 ℃黑暗培养[12]。发酵过程中，定期观察记录菌丝生长情况。并每隔7 d测量桦褐孔菌菌丝在瓶内生长的长度。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌形态特征

子实体呈块状，在树干上形成大小不等的团状物，菌核。菌核呈瘤状物、黑褐色或黑色，有不规则沟痕，内部呈棕色或黄褐色，直径为20～30 cm，表面很硬，干时脆。菌肉木柱质，有模糊不清的环纹，淡黄色。

图1 分离菌株的ITS序列Fig.1 ITS sequences of isolated strain

2.2 桦褐孔菌分子生物学鉴定

将测序获得的ITS序列与NCBI数据库收录序列(NCBI No. MH150820.1)进行比对分析，证明两者为同属同种，证明本试验所使用的菌种准确无误，保证材料的真实性(图1)。

2.3 品质鉴定

吕梁山桦褐孔菌菌核多糖含量极高，达到4.01 g/100g，其中的β-葡聚糖含量为6.25 mg/g；蛋白质含量2.82 g/100g；三萜类化合物0.74 %，黄酮含量4.9 mg/100g ，DPPH自由基清除抗氧化活性为93.90 %。有益矿物元素从高到低为K、Mg、Ca、Fe、Mn、Na、Zn，含量依次为40 532.4、2924.0、2824.2、1200.8、164.3、127、116.0 mg/kg。

2.4 桦褐孔菌固态发酵

2.4.1 桦褐孔菌在不同谷物培养基质上的发酵情况 桦褐孔菌在这十种谷物基质中均能发酵(表1)，萌发时间相同，都为1 d；在燕麦和薏米基质中发酵最快，菌丝生长速度分别为3.02和2.39 mm·d-1，且菌丝浓密程度都是较密，菌丝均为洁白(图2)；黄豆和大米中发酵速度次之，其生长速度菌在2 mm·d-1左右，无显著性差异，但大米中的桦褐孔菌菌丝致密程度欠佳且颜色发黄；在小麦和小米中菌丝生长速度分别为1.64和1.79 mm·d-1，小麦中的菌丝浓密洁白，但小米中的菌丝体颜色发黄且浓密程度与小麦相比欠佳。

在大豆中生长虽慢，菌丝生长速度为1.09 mm·d-1，但菌丝非常浓密，颜色洁白；而在藜麦和荞麦基质中，发酵初期菌丝比较浓密，颜色呈洁白，而到发酵后期则菌丝呈现黄色。桦褐孔菌在玉米中的发酵表现最为不佳，不仅生长慢且菌丝稀疏，全程菌丝发黄。

表1 桦褐孔菌在10种谷物培养基中的发酵情况Table 1 Fermentation of Inonotus obliquus in 10 grain media

注：+++表示菌丝浓密，++表示菌丝较密，+表示菌丝稀疏；同列不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Mycelium apparent density was classified as +++ (= dense), ++ (= soft), + (= faint); Values in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

图2 桦褐孔菌在各培养基质上的发酵情况Fig.2 Growth of Inonotus obliquus at the different stages of grain fermentation

在发酵试验中，发酵满瓶时间最短的是燕麦，仅需5 d即可完成；薏米和大米需要7周；小麦、玉米、黄豆和小米次之，为8周；荞麦和大豆基质中发酵时间是10周；藜麦完成发酵时间最长，长达到15周时间，并且由于发酵时间过长，菌丝已发黄老化。

2.4.2 桦褐孔菌谷物发酵过程中不同阶段的菌丝生长量 如图3所示，桦褐孔菌在十种谷物发酵过程中的不同阶段，其菌丝生长趋势基本一致，发酵菌丝在接种后2～4周内长满基质上表面并开始纵向向下生长，其中菌丝盖面时间为2周的是薏米、大米和小米，菌丝盖面时间为3周的是小麦、玉米、黄豆、藜麦和燕麦，而在大豆和荞麦基质中的菌丝盖面时间分别为4和5周，从第5和6周才菌丝才开始向下纵向生长。

在薏米、大米和小米中3种培养基中，前3周的菌丝生长长度分别为58.5、47.8、58.3 mm，薏米和大米培养基中7周发酵完成，小米培养基中8周完成发酵。综合计算，桦褐孔菌在薏米和小米固态发酵过程中前五周菌丝的生长长度分别为95.1和84.1 mm，分别占到总量的95.1 %和87.9 %；大米基质中，发酵前5周菌丝生长长度是99.3 mm，占到总量的98.9 %。

在燕麦、小麦、黄豆3种培养基中，前4周的菌丝生长长度分别为58.5、47.8、58.3 mm，小麦和黄豆培养基中8周发酵完成，而燕麦中仅需要5周时间。燕麦在第5周的菌丝生长长度仅有3.1 mm，前4周的菌丝生长量占到总生长量的96.8 %；在小麦培养基中，第6、7、8周的菌丝生长量分别为9、13.5、10 mm；在黄豆培养基中，发酵完成时间为7周，在第7和8周的菌丝生长量分别为5.3、1.3 mm，因此，前6周的菌丝生长量占到总生量的93.1 %和98.6 %。

在玉米基质中，8周完成发酵。前3周其菌丝生长量依次降低，分别是9.6、8.3和6.7 mm，到第4周时达到峰值37.8 mm，随后又依次降低，到第8周时菌丝生长量只有5.75 mm，因此，桦褐孔菌在前7周的菌丝生长量占到了总量的94.5 %。

在大豆和荞麦培养基中，均为10周发酵完成。大豆培养基中前5周的菌丝生长量为49.8 mm，而6周以后每周的生长量分别为8、4.9、4.1和3 mm，分别占到了总生长量的10.2 %、6.22 %、5.2 %和3.8 %；荞麦培养基中前5周菌丝生长量依次降低，在第6周达到高峰值，为46.798 mm，而后又依次降低，在第9周和第10周的菌丝生长量分别降到了3.14和3.28 mm，分别占到了菌丝总生长量的3.17 %和3.31 %。

在藜麦培养基中，桦褐孔菌15周才能完成发酵。前3周的菌丝生长量较小，只有15.3 mm，在第4周菌丝生长量达到峰值，为26.86 mm，随后几周一直保持在5 mm左右(第6周例外，为11 mm)，前6周菌丝生长量占总量的61.4 %，前8周菌丝生长量占总量的72.6 %，直到第15周发酵即将完成时，菌丝生长量降到了3 mm，达到最低值，占到菌丝总量的3.1 %，综合来看，后9周的菌丝生长量占到总量的38.6 %，而后7周仅占到27.4 %。

3 讨 论

桦褐孔菌是一种药用价值很高的、含有很多特殊功能成分的多年生大型真菌，可用于治疗各种消化道癌症、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血压，还能够改善过敏体质，增强免疫力[28]，目前对桦褐孔菌的生物活性成分以及功能效用的研究较多[12]。而对于食品应用领域的深度开发利用较少。虽然有一些例如桦褐孔菌多糖保鲜剂，桦褐孔菌的中药渣固体发酵，保健饮料研制，多糖口服液等，但是这些报道多数是关于桦褐孔菌的生物活性成分的研究，将桦褐孔菌的功能成分与风味物质经过发酵培养，融合制成具有人们喜欢的风味，同时又具有特效功能的食品原料，定会为健康饮食生活带来更好的前景。

图3 桦褐孔菌谷物发酵过程中不同阶段的生长情况Fig.3 Growth of Inonotus obliquus at the different stages of grain fermentation

桦褐孔菌主要集中分布在我国黑龙江、内蒙古和吉林地区的大兴安岭、小兴安岭和长白山。潘学仁等1996年于大兴安岭阿里河林区进行了森林真菌资源调查，在活桦树干上发现桦褐孔菌[23]。毕湘虹等2003-2005年从生态学角度对黑龙江省小兴安岭天然红松林林内的大型真菌进行了较全面的调查和研究，发现了在丰林国家自然保护区、凉水自然保护区和大海林林业局的红松阔叶混交林中有数量较多的桦褐孔菌，而红松云冷杉针叶混交林中则没有发现[24]。张跃华等从2003-2008年对位于黑龙江省东部地区小兴安岭南麓的大亮子河国家森林公园和临近的黑金河和腰营林场的野生大型经济真菌资源进行了全面、系统的调查，发现在红松阔叶混交林中同样也存在数量较多的桦褐孔菌，而红松云冷杉针叶混交林中则没有发现[25]。孙亚红等在地处大兴安岭北段的内蒙古根河市也发现了桦褐孔菌分布[26]。张春凤等在黑龙江省和吉林省的汪清、延吉、长白山、敦化都采集到了桦褐孔菌[27]。赵俊[12]等在1997年考察长白山木腐菌时发现，桦褐孔菌在长白山区只发生在海拔较高的活桦树上，特别是成熟树上。

近年来，本团队在山西省关帝山区(北纬37.5°，东经111.2°)的桦树上发现了桦褐孔菌(NCBI登录号MH150820.1)，是目前发现的生长在最南地区的种类。在本研究中，通过对采集自该地区的桦褐孔菌进行形态特征和环境条件的进行了分析，与大兴安岭的桦褐孔菌相比，形态特征相似，环境条件差异较大。通过测定山西桦褐孔菌的一些营养成分和化学成分含量等，发现多糖含量达4.01 g/100g，与大兴安岭的桦褐孔菌相比，超过其73.59 %，蛋白质含量为2.82 g/100g，低于大兴安岭桦褐孔菌；山西桦褐孔菌富含多种无机矿质元素，包括K、Mg、Ca、Fe、Mn、Na、Zn等20余种，其中K含量为40 532.4 mg/kg ，超过大兴安岭的桦褐孔菌93.1 %。可见采自山西吕梁山脉关帝山区的桦褐孔菌是多糖含量与钾含量极高的一个种类。通过组织分离得到了试验用山西桦褐孔菌的纯菌株，经分析其ITS序列，并进行了比对，相似性结果为100 %，证明为同种，保证了下一步桦褐孔菌谷物发酵使用菌种的准确性。

桦褐孔菌属稀有和濒危物种，野生资源极度匮乏，人工栽培虽有成功报道，但尚未实现规模化生产[6-10]。桦褐孔菌具有重要的药用功能，其发酵产物也具有多种保健作用，如抗肿瘤作用，抗氧化作用，降血糖作用，免疫调节作用等[29-34]，因此，采用桦褐孔菌菌丝体代替其菌核进行开发利用，不仅可以有效利用其功能成分，还能达到降低生产成本、减少野生资源破坏的效果。

谷物营养价值较高，深受人们喜爱。山西省小杂粮资源品种丰富、产品品质上乘、种植面积大且种类齐全，在国内外享有“小杂粮王国”之称，并以其独特的风味和营养保健功能备受现代人青睐。采用丝状真菌发酵谷物，可以提高其营养成分含量。通过对山西桦褐孔菌菌丝体在山西部分特色杂粮谷物中进行固态发酵培养，利用培养过程中真菌菌丝的发酵作用平衡杂粮谷物的营养成分，发酵产物经过烘干与粉碎，其中不仅包含有杂粮谷物原有的丰富的营养物质和菌丝体的功能性成分，还含有菌丝体通过发酵产生的多种酶类和代谢产物。这些都是生产功能食品(如面包、蛋糕、饼干)的好原料[35]。

在谷物固态发酵试验中，选用10种基质，分别是小麦、玉米、黄豆、藜麦、荞麦、薏米、燕麦、大豆、大米和小米，桦褐孔菌孔菌在这10种基质中均能进行固态发酵，即这10种固态发酵产物均可作为“桦菌谷物食品原料”。谷物固态发酵满瓶时间依次为8、8、8、15、10、7、5、10、7和8周；菌丝体总体生长趋势基本保持一致，均是前几周菌丝的生长量及生长速度一次降低，中间达到一个高峰值，后几周又依次降低；同一种谷物基质中每周菌丝体生长速度存在显著的差异。在藜麦基质中发酵最慢，发酵时间长达15周，且菌丝长势不好。在接种后的前八周时间里，菌丝生长量占到总量(满瓶菌丝长度)的72.6 %；荞麦、大豆基质次之，满瓶时间均为10周，但其菌丝长势最好，在接种后的前八周时间里，菌丝生长量占总量的91 %～94 %；在小麦、玉米、黄豆和小米基质中，发酵满瓶时间为8周，小麦中后3周菌丝生长量保持在10 mm左右，玉米中最后一周的生长量为5.75 mm，而黄豆培养基中后两周的生长量只有5.3、1.3 mm，前6周占到总量的93.1 %，小米中前5周的菌丝生长量占到总生长量的87.88 %；在薏米和大米基质中，发酵满瓶时间为7周，薏米前5周菌丝生长量占到总生长量的95.1 %，大米前6周占到了98.9 %；在燕麦基质中5周完成发酵，前4周菌丝生长量占到总生长量的96.8 %。

在制备“桦菌谷物食品原料”时，能充分利用桦褐孔菌在各谷物发酵中不同生长阶段的特点，选择好固态发酵所需谷物的装量和各谷物需要的发酵时间，以达到减少生产投入、降低生产成本的目的。以本次试验为例，桦褐孔菌的藜麦发酵可以在装料时选择谷物量为原重量(湿重150 g)的72.6 %，即108.9 g，当发酵至8周时结束发酵；桦褐孔菌的小米发酵可以在装料时选择谷物量为原质量的87.88 %，即131.8 g，当发酵至5周时结束发酵；桦褐孔菌在荞麦、大豆发酵时可选择谷物装量为136～141 g，当发酵至8周时结束发酵；玉米发酵可选择装量150 g，当发酵至8周时结束发酵；黄豆发酵可装量140 g，当发酵至6周时结束发酵；薏米发酵可装量143 g，当发酵至5周时结束发酵；大米发酵可装量148 g，当发酵至6周时结束发酵；燕麦发酵可装量145 g，当发酵至4周时结束发酵。

4 结 论

山西吕梁山南段的桦褐孔菌，作为目前发现的生长在最南地区的种类，与我国东北地区桦褐孔菌相比，其多糖含量极高、钾元素含量极高，具有很高的开发利用价值。本文首次对山西桦褐孔菌的相关研究进行了报道。现阶段我们对山西桦褐孔菌只进行了形态特征、分子生物学鉴定、环境条件分析、品质鉴定和固态发酵初步研究等，下一步还将对山西产桦褐孔菌进行更广泛深入的研究。