限制性外切酶I(EXO1)的合成、克隆与表达

谢钰珍，覃鸿妮，张 勇，赵文玮

(1. 苏州工业园区服务外包职业学院, 江苏 苏州 215123；2. 金唯智生物科技有限公司，江苏 苏州 215123)

【研究意义】基因组DNA作为真核生物最重要的遗传物质，决定人的相貌身高特征以及疾病的发生、发展。因此，生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究十分重要。DNA测序法是检测基因序列的最可靠方法。PCR产物直接测序最关键的因素就是模板质量。但PCR 产物中往往存在多余的引物和dNTP，这些小核苷酸片段的存在会使测序的底峰特别高，严重影响测序结果[1-3]。【前人研究进展】核酸外切酶I(Exonuclease I, Exo1)是一种单链的核酸外切酶，能够按照3'→5’的方向水解单链DNA，释放5'-单核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸完整[4]。因其可降解 PCR 混合物中的所有单链 DNA，所以在涉及测序或标记方法应用的 PCR 产物制备中极为有用。【本研究切入点】目前，由于表达量低、提纯步骤繁琐、得率低等因素的制约，商品化的核酸外切酶价格居高不下。而国内外研究中所使用的Exo1主要从各商业公司购置，对于开展大量测序工作的实验室来说，科研成本昂贵。【拟解决的关键问题】本研究通过重叠PCR技术体外合成sbcB基因，构建重组质粒后导入大肠杆菌，通过条件优化，实现该酶的异源大量表达，通过消化单链DNA和双链DNA验证其活性，旨在设计一种简单、高效和低成本的核酸外切酶I制备方法，为更多核酸酶的实验室制备提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 目的基因 sbcB基因编码的是核酸外切酶I，基因总长度为1428 bp，序列如图1。

1.1.2 菌株、质粒 载体质粒pET-30a，感受态细胞E.coliTop10，E.coliBL21(DE3)购自Novagen公司，T 7 expressionE.coli由本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的合成 ①重叠PCR合成sbcB基因:根据基因序列设计了42条引物，委托金唯智生物科技有限公司完成合成。将引物稀释到10 pmol/μl，每条引物取3 μl混匀作为引物混液(mix)，通过2轮PCR扩增出目的基因。PCR扩增体系及程序见表1。②PCR产物的检测与回收:吸取50 μl的二轮PCR产物点入浓度为1.5 %的回收胶，电泳仪220 V，280 mA电泳20 min。回收产物即所得目的基因。

图1 sbcB基因序列Fig.1 The sequence of sbcB gene

表1 PCR体系和PCR程序Table 1 PCR system and PCR procedure

1.2.2 重组表达载体的构建及转化 ①将质粒pET30a用NdeI 和KpnI酶切，酶切体系见表2；酶切体系配好后，37 ℃水浴锅反应30 min。琼脂糖凝胶电泳切胶回收。②将酶切后的表达载体pET-30a与sbcB基因进行连接，构建重组载体pET-30a-sbcB。连接体系见表3。PCR仪50 ℃连接60 min后，将连接产物转化至Top10感受态中，37 ℃过夜培养。

表2 酶切反应体系Table 2 Enzyme digestion system

1.2.3 阳性克隆的筛选与鉴定 挑取24个单克隆37 ℃扩大培养，利用菌落PCR扩增目的基因(菌检体系及程序见表4)，电泳检测到目的条带的克隆送测序进一步验证。

表3 重组反应体系(20 μl)Table 3 Recombination reaction system(20 μl)

表4 菌检PCR反应体系及程序Table 4 Reaction system and procedure of Colony PCR

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化 将测序正确的阳性重组质粒转化至BL21(DE3)中，菌液涂布于含kan抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。选取多个重组菌落接种LB液体培养基中，37 ℃，220 r/min培养至OD值为0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG继续诱导2 h。离心，收集菌体。将诱导后的菌体重悬于lysisbuffer，超声破碎后离心去沉淀，收集样品液。蛋白纯化机纯化蛋白。10 %聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物，检测表达产物的分子量及纯化效果。

1.2.5 表达产物的功能验证 以S1核酸外切酶为标准对照，分别用该酶和表达产物EXO1酶消化仅含单链DNA的样本(stap-tri-ssDNA)和单双链混合的DNA样本(DSG-SSDNA)，琼脂糖凝胶电泳检测消化结果。

2 结果与分析

2.1 目的基因的合成

因目的基因总长1428 bp，为了提高合成成功率，分两段进行合成。目的基因的电泳检测结果如图2所示，sbcb(1～22)和sbcb(21～42)的理论值分别为785和791 bp。从图上可看出扩增的条带大小均在750～1000 bp之间，与预期理论值基本相符，可判断目的基因扩增成功。

1～4为sbcb(1～22)重复样；5～8为sbcb(21～42)重复样，M为DNA 5000 Marker1-4: Amplification of sbcB(1-22);5-8: Amplification of sbcB(21-42);M:DNA 5000 Marker图2 sbcB基因PCR扩增产物Fig.2 PCR amplification of sbcB gene

图3 重组表达载体菌落Fig.3 Bacterial colony of pET-30a-sbcB

2.2 重组质粒载体pET-30a-sbcB的筛选与鉴定

2.2.1 LB固体培养基菌落生长情况 经隔夜培养，固体培养基上长出了菌落，菌落白色圆润无其他杂菌(图3)，挑选出单斑进行菌检PCR。

2.2.2 菌落PCR电泳图 菌检时使用的引物为T7和T7T，这是一对在载体pet30a与目的产物连接处附近最恰当的引物，菌检出的目的条带的大小应为1674 bp。从电泳图上可以看出，大部分克隆的大小在1500～2000 bp之间，与理论值相符(图4)。随机挑取4个大小相符的克隆测序，结果与目的基因序列一致，阳性克隆筛选成功。

2.3 重组蛋白的表达与纯化

重组pET-30a-sbcB质粒在大肠杆菌BL21中以胞内可溶性形式高效表达。超声破菌后，经亲和柱层析，15 %SDS-PAGE鉴定显示目的蛋白。从图5可以看出，表达产物在54.5 KD处呈现清晰的蛋白带，分子量大小与预期结果一致，蛋白纯化成功。

2.4 表达产物的功能验证

2.4.1 消化单链DNA样本(stap-tri-ssDNA) stap-tri-ssDNA大小为350 bp左右。从图6看出，阳性对照(Line4)条带正常，说明样品没问题。Line2和Line3 350 bp处均无条带，说明EXO1和S1一样，能去除单链。且由Line1和Line2的对比可显示出，EXO1对于单链的去除有非常重要的作用，有FastAP无EXO1，则无法去除单链。

图4 菌落PCR产物Fig.4 Colony PCR products

M：低分子量标准蛋白质；1：BL21(DE3)/pET-30a-sbcB 的诱导表达产物M：Low molecular protein marker；1：Induced expression of BL21(DE3)/pET-30a-sbcB图5 重组表达载体pET-30a-sbcB诱导表达蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of induced recombinant pET-30a-sbcB

Line1为只加FastAP、未加EXO1消化后条带；Line2为有FastAP和EXO1存在下的消化后条带；Line3为S1消化后条带；Line4为未加任何酶消化的stap-tri-ssDNA条带Line1: The result of the functioning of FastAP without EXO1;Line2: The result of the functioning of FastAP with EXO1;Line3: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line4: Blank control图6 S1核酸外切酶和EXO1分别消化stap-tri-ssDNA结果图Fig.6 Digestion products of stap-tri-ssDNA

2.4.2 消化单双链DNA混合样本(DSG-SSDNA) DSG-SSDNA样品中既有单链又含有双链，双链条带大小理论值为594 bp，单链条带大小理论值为400 bp。由图7可以看出，阳性对照Line3明显有两条带，大小与理论值相符，说明样品及加样操作无问题。Line1和Line2只有1条带，大小594 bp左右，说明样品中的单链均被消化掉了。证明表达产物EXO1和S1核酸外切酶一样，可消化单链，但并不会消化双链。

3 结论与讨论

核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3’-5’-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶，其水解的最终产物是单个核苷酸。按作用的特性差异可将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。核酸外切酶I(Exonuclease 1, EXO1)属于单链的核酸外切酶，能够从单链DNA(ssDNA)的3’-OH到5’-P末端逐个催化水解碱基对之间的磷酸二酯键，释放5'-单核苷酸并保持末端 5'-二核苷酸的完整。EXO1除了参与DNA复制、DNA错配修复(MMR)以及DNA双链断裂修复等过程外，还与肝癌、肺癌、卵巢早衰等疾病的发生发展密切相关[5-7]。

近年来，随着基因组学研究的深入，测序技术发展迅猛[8]。PCR产物作为常见的测序模板，其质量直接影响测序结果。有研究证实，纯化后的PCR产物测序的成功率及测序质量明显高于非纯化的PCR产物。因此，要得到理想的测序结果，必须在测序前对PCR产物进行纯化，以清除PCR反应中残留的dNTPs、引物和盐离子。因核酸外切酶 I 可降解原PCR反应中残存的的单链引物和任何在PCR中产生的外来单链DNA。虾碱性磷酸酶(SAP)可去除PCR混合物中残留的dNTPs，SAP-EXO1纯化法成为了测序前PCR产物处理的常用方法之一[9]。纵观国内外研究，实验用EXO1大多购自商业公司，虽然该法操作简单、快捷，昂贵的EXO1一定程度上限制了其应用。若能自行合成，并高效表达目的蛋白，可极大程度的降低科研成本。

Line1为EXO1酶消化后的条带；Line2为S1核酸外切酶消化后的条带；Line3是空白对照，为未加任何酶消化的DSG-SSDNA条带；Line4为MarkerLine1: The result of the functioning of EXO1;Line2: The result of the functioning of Exonucleases S1;Line3: Blank control;Line4: Marker图7 S1核酸外切酶和EXO1酶分别消化DSG-SSDNA结果图Fig.7 Digestion products of DSG-SSDNA

sbcB基因，一种大肠杆菌中的核酸外切酶I，天然存在于E.colik-12中。由于生长环境及其他因素的影响，目的蛋白表达严重受限，表达量低。大肠杆菌T7噬箘体有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系，最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平[10-11]。因此本研究首先用重叠PCR技术体外人工合成sbcB基因，成功构建重组载体sbcB-pET-30a后再将该质粒转化到BL21(DE3)感受态中，诱导表达并获得目的蛋白。因BL21(DE3)大肠杆菌的染色体中已经被整合了编码T7RNA聚合酶的基因，并且位于LacUV5启动子的下游，所以在质粒转入后，T7RNA能够特异性识别T7启动子，开启下游基因的转录，最终实现了目的蛋白(EXO1)的高效表达。后续的功能验证也证实：EXO1可消化单链且不会消化双链，能够适用于实验室中测序前PCR产物的处理，并且在单链DNA QC时或许可以代替S1核酸外切酶。事实上EXOI酶的功能远不止这些，该酶的成功表达为后续更深入的功能研究奠定了良好基础，也为其他核酸酶的发现与成功克隆提供了一定的参考价值。