高产乙酸乙酯酵母菌株的筛选

陈 雪，孟勤燕，齐 欢，王 珍，李浩浩，闫宗科

（陕西西凤酒股份有限公司，陕西凤翔 721406）

白酒是我国传统的酿造食品，是以高粱等淀粉质原料为主料，采用大曲作为糖化、发酵剂，经固态发酵和蒸馏而制成的一种饮料酒[1-2]。作为中国特有的传统酒种，白酒是中华民族的瑰宝，是世界六大蒸馏酒之一，以其香型多样、工艺特殊，色泽、香气、口味、风格独树一帜[3]。白酒除98%的乙醇和水以外，其余2%主要为酸、酯、醇及其他一些微量组分。尤其是酯类的含量和比重决定着白酒的香型和品质[4]。

乙酸乙酯是我国白酒中含量较多的香味物质之一，尤其是对清香型、凤香型和米香型等白酒的风格及成型具有重要作用[6]。乙酸乙酯沸点为77 ℃，感官阈值为17.0 mg/L（32 m g/L），具有苹果味香气，刺激带涩，味短[7]。乙酸乙酯主要由微生物尤其产酯类酵母代谢产生。产酯酵母又称生香酵母，主要包括产酯酵母和假丝酵母，是白酒产香的主要菌种之一，产酯酵母主产乙酸酯类，特别是乙酸乙酯[9]。产酯酵母能够以乙醇为碳源，既具备乙醇发酵能力，又具备醋酸发酵能力，能以糖、醛、有机酸、盐类等物质为养料，在酯酶作用下合成酯类[10]。目前已报道的高产乙酸乙酯的酵母主要是汉逊酵母[11-12]、假丝酵母、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、异常毕赤酵母（Picha anomala）[12-13]、平常假丝酵母（Candida inconspicua）[10]等酵母种属。

如何提高白酒中酯类的含量是白酒生产者普遍关注的问题。20 世纪70 年代以来，我国许多酒厂采用纯种培养产酯酵母，应用于白酒生产，显著改善及提高了酒质，产酯酵母的功能因此受到人们的重视。凤香型白酒其主要香气是以乙酸乙酯为主，己酸乙酯和高级醇为辅的复合香气。因此，筛选适合凤香型白酒酿造的优质高产乙酸乙酯功能菌株，对凤香型白酒优质高效酿造具有实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌株、试剂

菌种：企业技术中心保藏的酵母菌株22 株、酒醅中分离的酵母菌株78株。

试剂及耗材：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、麦芽浸粉、盐酸、氯化钠、硫酸、无水乙醇。

1.1.2 培养基

麦芽汁培养基：12°Bx 麦芽汁，分装，115 ℃灭菌20 min。

YPD 液体培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1000 mL，以115 ℃灭菌30 min。

PDA 液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1000 mL，115 ℃灭菌30 min。

TTC 下层培养基：葡萄糖10.1 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.5 g，琼脂30 g，酸性磷酸钾1.0 g，硫酸镁0.4 g，柠檬酸0.27 g，水200 mL。

TTC 上层培养基：TTC 0.5 g，葡萄糖0.5 g，琼脂1.5 g，水100 mL。配制5%TTC 溶液（避光下用温水溶解，经0.22 μm 醋酸纤维膜过滤后，4 ℃冰箱保存备用）待培养基温度降到50 ℃，添加1 mL 到100 mL培养基中。

高粱汁：取高粱粉1 份，加入4 份自来水煮1～2 h，按使用说明加入淀粉酶液化，液化后补加60 ℃温水1 份，加入原料量的5%糖化酶（5 万活力单位），搅拌均匀，以60 ℃糖化3～4 h，用稀碘液试之不显蓝色，再加热至90 ℃。用细纱布过滤后加热浓缩。调整糖度至12°Bx，20%硫酸调至pH4.5，分装至三角瓶中，115 ℃，灭菌20 min。

固态发酵培养基：粉碎后高粱300 g，加90 ℃水270 mL，90 ℃润粮5 h，100 ℃灭菌120 min。取出摊晾，加入45 g 清蒸稻壳，添加1%乙酸，无菌水调整水分在63%～65%。

1.1.3 仪器设备

生化培养箱、恒温调速回转式摇床、冷冻高速离心机、紫外分光光度计、显微镜、微生物鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌株的分离纯化

取高产乙酸乙酯班组的酒醅，称取10 g 酒醅于含90 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，200 r/ min 振荡浸提30 min，吸取上清液，稀释到合适浓度，选3个浓度梯度，取200 μL 涂布于孟加拉红平板。30 ℃培养3 d 后，挑取生长良好的酵母单菌落进一步划线分离2～3 次，经镜检为纯种后分别转入YPD固体斜面，培养好后4 ℃冰箱保藏[14]。

1.2.2 高产乙酸乙酯酵母的筛选

初筛：菌株经活化接入12°Bx麦芽汁液体培养基，30 ℃培养7 d，每株菌做2 个平行，进行风味嗅闻评定，记录各菌株酯香味（香蕉、苹果等香味）的强弱。同时以不接菌的平板和液体培养基为空白，筛选出酯香浓郁、香气独特的酵母菌。

复筛：复筛酵母菌在液体YPD 中活化，30 ℃，100 r/min，16～24 h。以相同接种量（1×107cfu/mL）分别接入装有120 mL 12 °Bx 高粱汁的三角瓶中，安装发酵栓并称重，置于30 ℃培养箱中恒温培养，每隔24 h 称重，记录失重量，当失重量小于0.2 g 时停止培养，每个菌做2 个平行。发酵结束后，测理化指标和乙酸乙酯含量。

乙酸乙酯的测定：取100 mL 发酵液至500 mL圆底烧瓶中，加入100 mL 60%乙醇进行蒸馏，收集100 mL 馏分[11]，皂化法测定总酯，同时以40%vol无酯酒精做空白。总酯高的样品，继而用气相色谱测定乙酸乙酯的含量。

1.2.3 高产乙酸乙酯酵母耐受性的测定

酒精耐受性：在试管中添加YPD 液体培养基5 mL 并加入杜氏管，灭菌之后分别加入无水乙醇调整初始酒精浓度为8%vol、10%vol、12%vol、14%vol，将活化好的菌株按接种量为106cfu/mL接入，设置3个平行，30 ℃恒温静置培养，每隔12 h观察产气，观察10 d。

同理测定温度（32 ℃、35 ℃、38 ℃、40 ℃）耐受性，酸度(初始pH 值为2.5、3.0、3.5、4.0)耐受性，恒温静置培养，每隔4 h 观察产气，3 d 后在600 nm 条件下测定吸光度。

1.2.4 优选菌株发酵条件的优化

正交实验：考察发酵温度、发酵时间、pH 值、酒精度4个因素对其产乙酸乙酯量的影响[16]，按L16(45)进行正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。

通过正交试验获得酵母菌株产酯的最佳工艺条件，进行3次在该优化产酯条件下的验证试验。

1.2.5 固态发酵小试

模拟凤香型白酒生产工艺，固态发酵培养基摊晾至温度30 ℃左右添加20%大曲，MY0-3 酵母菌接入量为1×107cfu/g，拌匀后每3000 g 分装入5 L玻璃罐中，盖上塞子，缠上保鲜膜，置于恒温培养箱中，30 ℃培养。20 d 发酵结束后，测定乙酸乙酯和基本理化指标（水分、酸度、还原糖、酒精度）。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株的分离

在酒醅中共分离出78 株酵母菌株，在平板上进行闻香及TTC 显色试验。筛选出具有浓郁香气的菌株为1-5、7、10、13、16、17、73-75、25、26、28、32、33、41、43、57、59、69-72，共计26 株，具体结果见表2。

表2 分离菌株的平板筛选

2.2 高产乙酸乙酯菌株的筛选

初筛：对26 株筛选的酵母菌株进行活化，以106cfu/mL 浓度接入50 mL、12°Bx 麦芽汁，30 ℃培养7 d 后进行闻香。筛选出7、10、13、17、25、43、59、57、71、72、74，共计11 株菌株，具有中等至浓郁的香气。通过微生物鉴定仪进行菌株鉴定，鉴定出6株，结果见表3。

液体发酵复筛：将产酯的强化菌株4 株、现存相关酵母菌株20 株以及酒醅中筛选的酵母6 株，共计30 株。统一进行12 °Bx 高粱汁液体发酵，发酵结束后，测总酯及基本理化指标，选总酯较高的样品测定乙酸乙酯含量，实验结果见表4。产乙酸乙酯含量最高的菌株是MY0-3，乙酸乙酯产量达到3.73 g/L；其次具有高产乙酸乙酯潜力的菌株为MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6、74，乙酸乙酯产量分别为0.63 g/L、0.46 g/L、0.35 g/L、0.33 g/L、0.23 g/L、0.33 g/L、0.16 g/L。其中MY0-3 具有高产乙酸乙酯、低产乙醇、增酸及发酵较彻底的特点；C3 具有低产乙醇、发酵较彻底、产酸最少等特性；Y1、B003、B005、74具有高产酒精特性。

表3 闻香优选菌株

表4 液体发酵复筛结果

2.3 优选菌株耐受性（图1、图2，表5—表7）

结果显示，MY0-3、B003、B005 具有较低的酒精耐受性，最高耐受8%vol；C3、MY5-9、Y1最高耐受10%vol 的酒精，P6、74 酒精耐受性最高，可耐12%vol～14%vol 的酒精。菌株MY0-3 和MY5-9最高耐受3.0 的酸度，其他均可耐受2.5 的酸度。MY0-3 和B005 最高耐受35 ℃，B003 最高耐受温度为38 ℃，C3、Y1、P6、74、MY5-9 均可耐受41 ℃的温度。综合以上，菌株MY0-3 具有较低的酒精耐受性和温度耐受性，P6、74 具有较高酒精耐受性和温度耐受性。

表5 优选菌株的酒精耐受性(产气)

表6 优选菌株的温度耐受性(产气)

2.4 产酯条件优化

L16(45)正交试验进行产酯发酵条件优化，以乙酸乙酯的产量为评价指标，选择发酵温度、发酵时间、pH值、酒精度4个因素，研究其对高产乙酸乙酯MY0-3 菌株产酯的影响，确定最佳的产酯工艺条件，正交试验结果与分析见表8，方差分析结果见表9。

由表9可知，各影响因素对酵母MY0-3产酯的影响程度为RC＞RD＞RA＞RB，即发酵温度＞发酵时间＞pH 值＞酒精度。综合分析得到产酯最佳方案为A2B2C1D4，即发酵温度25 ℃，发酵时间9 d，pH3.5，酒精度2%vol。在该优化产酯条件下，通过3 次验证试验，得到酵母菌株MY0-3 产乙酸乙酯的量为6.2 g/L。

2.5 固态发酵小试实验

表8 产酯条件优化正交试验结果

表9 正交试验结果方差分析

制作MY0-3 麸曲应用于高粱固态发酵小试，对照组为凤型大曲，实验组为凤型大曲+MY0-3 麸曲，固态发酵小试的基本理化指标见表10。发酵20 d 时，实验组比对照组的乙酸乙酯含量高19.5%，发酵27 d 比对照组高17.8%。实验组的乙酸乙酯含量随发酵周期的延长而呈增加趋势，酒精度在发酵后期略有下降。

表10 MY0-3固态发酵小试基本理化指标

3 结论

通过对实验室现存酵母菌株及酒醅中分离酵母的筛选，共获得具有高产乙酸乙酯特性的酵母菌株8 株，依次排序分别是MY0-3、MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6 和74。测定优选菌株的酒精、酸度及高糖耐受性，MY0-3 具有较低的酒精耐受性，最高耐受8%vol，最高耐受35 ℃；最高耐受3.0 酸度。通过正交试验优化MY0-3 的产酯发酵条件，优化的发酵条件为pH3.5，酒精度2%vol，温度25 ℃，发酵时间9 d，乙酸乙酯的产量为6.2 g/L。应用MY0-3 的固态发酵小试中，发酵20 d，乙酸乙酯含量实验组比对照组高19.5%。