HPLC 法同时测定感冒止咳颗粒中10 种成分

何 艳，胡小祥，王 庆∗

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000）

感冒止咳颗粒由柴胡、山银花、葛根、黄芩、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷脑9 味药材组成，可用于外感风热所致感冒，症见发热恶风、头痛鼻塞、咽喉肿痛［1］。方中柴胡、山银花疏散退热，共为君药；葛根解肌退热，青蒿退虚热，连翘、黄芩清热解毒，共为臣药；桔梗、苦杏仁宣降肺气以止咳化痰，薄荷脑芳香辛散，共为佐药，诸药合用，共奏清热解表、止咳化痰之功效。感冒止咳颗粒收载于2015 年版《中国药典》，但仅以黄芩苷为定量测定的指标成分，而相关报道也只主要针对其中1～3 种成分［2-6］。

中药复方制剂组成复杂，单一成分检测难以有效控制其质量和疗效的稳定性，多指标成分测定已成为相关质量评价的发展趋势。感冒止咳颗粒中君药山银花主要有效成分为有机酸类，包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等［7-8］；臣药葛根主要含有异黄酮类，包括葛根素、大豆苷元等［9］，青蒿所含成分主要为挥发油类、香豆素类、苯丙酸类，其中绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸为苯丙酸类代表性物质［10-11］，连翘主要有效成分为连翘苷、连翘酯苷A［12］，黄芩主要活性化合物有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等［13］。本实验建立HPLC 法同时测定感冒止咳颗粒中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的含有量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置G1311B 四元泵、G1329B 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D DAD 检测器（美国Agilent Technologies 公司）；XSE-205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸（批号110753-201716，纯度99.3%）、葛根素（批号110752-201615，纯度95.4%）、连翘酯苷A（批号111810-201606，纯度93.4%）、异绿原酸C（批号111894-201102，纯度94.1%）、黄芩苷（批号110715-201619，纯度93.5%）、汉黄芩苷（批号112002-201702，纯度95.9%）、黄芩素（批号111595-201607，纯度98.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸（批号18031001，纯度99.67%）、隐绿原酸（批号18032403，纯度99.07%）、异绿原酸A（批号18032601，纯度98.82%）对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司。小儿解表颗粒（批号ZBB1916、ZBB1909，云南白药集团股份有限公司），批号180502 的购自江西铜鼓仁和制药有限公司，批号1811016 的购自太极集团四川绵阳制药有限公司。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；磷酸、甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，8%～16%A；20～25 min，16%～20%A；25～35 min，20%～30%A；35～50 min，30%～40%A；50～50.1 min，40%～8% A；50.1～55 min，8% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长326 nm（0～15.5 min）、250 nm（15.5～20 min）、326 nm（20～35 min）、278 nm（35～55 min）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品新绿原酸5.57 mg、绿原酸7.43 mg、隐绿原酸7.03 mg、葛根素8.02 mg、连翘酯苷A 10.17 mg、异绿原酸A 6.37 mg、异绿原酸C 7.36 mg、汉黄芩苷9.14 mg、黄芩素5.67 mg，置于25 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为贮备液；精密称取黄芩苷对照品3.81 mg，置于25 mL 量瓶中，精密吸取上述贮备液（新绿原酸2 mL、绿原酸2 mL、隐绿原酸3 mL、葛根素4 mL、连翘酯苷A 2 mL、异绿原酸A 1 mL、异绿原酸C 1.5 mL、汉黄芩苷2 mL、黄芩素1 mL）至该量瓶中，振摇，70% 甲醇定容，摇匀，即得（含新绿原酸17.77 μg／mL、绿原酸23.61 μg／mL、隐绿原酸33.43 μg／mL、葛根素48.97 μg／mL、连翘酯苷A 30.40 μg／mL、异绿原酸A 10.07 μg／mL、异绿原酸C 16.62 μg／mL、黄芩苷142.5 μg／mL、汉黄芩苷28.81 μg／mL、黄芩素8.936 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取颗粒适量，研细，取粉末约1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，称定质量，超声（功率300 W、频率40 kHz）处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方工艺，分别制备缺山银花和青蒿、缺葛根、缺连翘、缺黄芩的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离效果良好，分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，各精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、葛根素、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积RSD 分别为1.08%、0.44%、0.46%、0.27%、0.65%、0.15%、0.20%、0.65%、0.13%、0.73%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号1811016），于0、4、8、16、24、36 h 在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、葛根素、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积RSD 分别为1.67%、1.22%、0.67%、0.69%、1.34%、1.13%、0.54%、0.37%、0.93%、1.76%，表明溶液在36 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批样品6 份（批号1811016），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、葛根素、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素含有量RSD 分别为1.25%、0.55%、0.43、0.32%、2.23%、1.80%、1.04%、0.67%、0.37%、2.12%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含有量已知的同一批颗粒（批号1811016），研细，取粉末约0.5 g，精密称定，共6 份，精密加入对照品溶液（0.153 1 mg／mL 新绿原酸2 mL、0.206 9 mg／mL绿原酸2 mL、0.250 8 mg／mL 隐绿原酸2 mL、0.301 1 mg／mL 葛根素2 mL、0.190 0 mg／mL 连翘酯苷A 1 mL、0.150 6 mg／mL 异绿原酸A 1 mL、0.312 4 mg／mL 异绿原酸C 1 mL、0.219 9 mg／mL黄芩苷10 mL、0.199 2 mg／mL 汉黄芩苷2 mL、0.088 62 mg／mL 黄芩素1 mL），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、葛根素、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素平均加样回收率分别为99.54%、101.25%、99.89%、98.05%、99.69%、99.51%、99.07%、101.75%、101.95%、101.09%，RSD 分别为2.05%、1.07%、1.10%、0.45%、1.85%、2.07%、1.87%、1.65%、1.41%、2.28%。

2.9 样品含有量测定 精密称取4 批颗粒，每批3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分选择 本实验曾考察了感冒止咳颗粒另一君药柴胡中柴胡皂苷a［14］，发现其含有量较低，甚至有些样品未检出，故未予以考虑。前期预实验发现，连翘中连翘苷含有量低，均匀性差，故选择另一指标性成分连翘酯苷A。最终，选择新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、葛根素、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素作为指标成分，涵盖了感冒止咳颗粒君药、臣药，能较全面地反映其质量。

3.2 检测波长选择 本实验采用DAD 检测器在200～400 nm 范围内进行全波长扫描，并采集光谱图。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘酯苷A 在326 nm 波长处有最大吸收，葛根素在250 nm 波长处有最大吸收，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素278 nm 波长处有最大吸收，故选择326 nm 作为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘酯苷A 检测波长，250 nm 作为葛根素检测波长，278 nm 作为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素检测波长。

3.3 色谱条件优化 本实验首先考察了Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），发现以 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分离效果最好，色谱峰对称性理想。再考察了流动相乙腈-水、乙腈-0.1% 乙酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2% 磷酸［15-16］，发现以乙腈-0.1%磷酸洗脱时各成分达到了理想的分离效果，色谱峰对称性良好，故选择其作为流动相。

3.4 含有量分析 表3 显示，感冒止咳颗粒（批号180502）中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、葛根素、连翘酯苷A 含有量较低，故为了保证产品质量、临床疗效稳定性，建议将山银花、葛根、连翘指标性成分纳入该制剂定量测定中。