高速逆流色谱法分离制备厚朴中magnoloside A

胡小龙，姜 峰，张 敏，王月荣，章弘扬，胡 坪∗

（1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海市功能材料化学重点实验室，上海 200237；2.华东理工大学药学院，上海市新药设计重点实验室，上海 200237）

厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥湿消痰、下气除满的功效，在我国已经有两千多年的药用历史。厚朴中含有大量木脂素、苯乙醇苷类化合物［1-2］，其中的magnoloside A 也称为木兰苷A、厚朴苷A，是药材中最主要的苯乙醇苷类化合物之一，具有良好的抗菌［3］、抗氧化［4］能力，可用于乙酰胆碱抑制剂［5］。

从中药有效成分中开展新药研发，是中药现代化重要途径。目前，对厚朴中主要活性成分厚朴酚、和厚朴酚的分离、活性、质量研究相对较多，而鲜有涉及magnoloside A，这是由于它一般采用制备色谱分离，分离过程复杂［1，4，6］，对照品价格贵，不易获得。

高速逆 流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是由Ito［7］博士于1966 年提出的一种液液分配色谱，无需固体支持，进样量较大，被广泛应用于抗生素、蛋白质、农药、天然产物［8-11］等分离、制备及分析中，已有研究将该方法应用于厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的分离制备［12-13］。本实验首次通过HSCCC 法对厚朴粗提物中的magnoloside A 进行分离制备，以期为该成分后续研究奠定基础。

1 材料

TEB 300C 高速逆流色谱仪（上海同田生物技术股份有限公司）；PB1501-N 精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FD-1A-50 冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；DLSB 旋转蒸发器（上海予华仪器有限公司）；实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；Agilent 1100 高效液相色谱仪、Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美国Agilent 公司）。

magnoloside A 对照品（自制）。厚朴由河北神威药业集团有限公司提供，产地四川都江堰，经华东理工大学胡坪教授鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。甲醇为色谱纯，购于美国ACS 公司；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇等为分析纯，购于上海泰坦科技股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 厚朴粗提物制备 称取药材100 g，加入80% 乙醇1 000 mL回流提取2 h，提取液减压浓缩至100 mL，等体积正己烷萃取3 次，弃去正己烷相，水相再用等体积水饱和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇相，减压浓缩至干，加水复溶后冷冻干燥，即得（8.8 g），得率为8.8%。

2.2 magnoloside A 含有量测定［14］色谱条件为Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相醋酸（pH＝3.0）（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～40 min，19%～35% B）；检测波长328 nm；体积流量1 mL／min；柱温35 ℃；进样量5 μL。粗提物色谱图见图1。

由此可知，图中色谱峰数较多，组成较为复杂，以自制的magnoloside A 为对照品，测得粗提物中该成分含有量为14.3%，回收率为79.5%。称取一定量粗提物，加入溶剂系统的下相溶剂15 mL，超声溶解，即得HSCCC 样品溶液。

图1 厚朴粗提物HPLC 色谱图

2.3 溶剂体系筛选 影响HSCCC 分离效果的因素较多，以溶剂体系最为主要。合适的溶剂体系应具备以下特性：样品在两相中有合适的分配系数 ［一般认为分配系数（K值）应该在0.5～2 范围内］；两相有较短的分层时间；两相对样品的溶解度良好，并且不造成其分解变性［15］。在筛选溶剂体系时，主要考察添加样品后溶剂分层时间与成分在上下相的K值，公式为K＝CS／CM，其中CS、CM分别为目标成分在上、下相中的含有量。

本实验借鉴苯乙醇苷类化合物常见的HSCCC 分离体系［16-18］，结合magnoloside A 极性，选择乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水作为分离体系，考察其不同比例对magnoloside AK值的影响。取约2 mg 样品，加入待考察溶剂系统2 mL，摇匀，静置分层，取下相进行HPLC 分析；再取一定体积上相，氮气吹干，甲醇复溶，进行HPLC 分析，测量目标成分在两相中的含有量，计算K值，结果见表1。

表1 magnoloside A 在不同溶剂体系中的K 值

由此可知，溶剂系统2、4 的K值大于3，会使magnoloside A 在体系内保留时间过长，从而增加分离时间和溶剂消耗量，其余溶剂体系都比较适合。但由于厚朴提取物成分较复杂，溶剂体系1 的K值过小，magnoloside A 与相邻杂质分离度较差；溶剂体系3、5 对magnoloside A 的分离效果较好，考虑到节省溶剂和时间，最终确定的溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）。后续实验前，在分液漏斗中加入上述两相溶剂体系，剧烈振摇使其充分混合，静置分层，上、下相各超声脱气20 min，分别作为固定相、流动相，备用。

2.4 流动相体积流量及仪器转速优化 在HSCCC 实际操作过程中，流动相体积流量和仪器转速会在很大程度上影响固定相保留率。而保留率越高，化合物萃取越充分，所得化合物纯度也越高。

本实验固定体系温度为25 ℃，选择转速700、850、900 r／min，分别以体积流量3、4、5、7 mL／min 泵入流动相直至体系平衡，计算固定相保留率，以固定相的保留率和体积流量的平方根作图，结果见图2。由此可知，不同转速下方程线性关系良好，与文献［19］报道相符；当转速为850 r／min、体积流量为3 mL／min 时，固定相保留率最高。

图2 不同转速下体积流量平方根与保留率之间的关系

2.5 体系温度筛选 HSCCC 体系的温度对固定相保留率也有一定影响。固定转速850 r／min、体积流量3 mL／min，选择体系温度25、30、35、40、45 ℃，泵入流动相直至体系平衡，计算固定相保留率，以温度和保留率作图，结果见图3。由此可知，适当提高温度在一定程度上可增加固定相保留率，与文献［16］报道一致；但温度过高会影响化合物稳定性，同时会造成固定相一定程度的挥发，故选取45 ℃作为最佳柱温，保留率为73.3%。

图3 温度与保留率之间的关系

2.6 样品进样量筛选 进样量增大有利于提高制备通量，但同时也可能引起超载，使色谱峰展宽，分离度下降，化合物纯度降低。取厚朴粗提物500、750、1 000 mg，溶于15 mL 下相中，在优化的分离条件下比较不同进样量时目标化合物在HSCCC 色谱图上的分离度，并以其纯度和产率为指标筛选进样量，结果见图4、表2。由图4 可知，进样量由500 mg 升至1 000 mg时，magnoloside A 与其他组分的分离度仍较好；由表2 可知，不同进样量下magnoloside A纯度和产率都比较接近，故可采用较大的进样量。另外，若只收集峰顶部分的馏分，则纯度可大于98%。

图4 magnoloside A 流出曲线

表2 不同进样量下magnoloside A 产率、纯度测定结果

2.7 magnoloside A 分离纯化 以正丁醇-乙酸乙酯-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）上相作为固定相，下相作为流动相，采用头进尾出、正转的模式，泵入固定相，待上相完全充满整个逆流色谱柱后，打开色谱仪，设置转速850 r／min、体积流量3 mL／min、检测波长327 nm、温度45 ℃，将下相泵入螺旋管中，待流动相开始从检测器尾端持续流出时，表明螺旋管内两相溶剂达到流体动力学平衡。取溶解于下相、质量浓度为1 000 mg／15 mL 的厚朴粗提物溶液，通过进样阀进样，持续泵入流动相开始分离。收集206～260 min馏分，减压回收溶剂，冷冻干燥，得到化合物121.9 mg，纯度达95.8%（图5），回收率为81.7%，完成一次进样时长为270 min。

图5 magnoloside A HPLC 色谱图

2.8 结构鉴定 化合物为淡黄色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂。水溶液中最大吸收波长为217、290、328 nm。ESI-MSm／z：623 ［M-H］-，分子式为C29H36O15。红外KBrmax（cm-1）：3 410（OH），1 686（C＝O），1 634（C＝C），1 604，1 523（苯环）。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：1.27（3H，d，6.1 Hz），2.83（2H，t，6.4 Hz），3.48（2H，t，9.6 Hz），4.11（1H，q，9.2 Hz），4.99（1H，bs），5.80（1H，bs），6.44（1H，d，15.6 Hz），6.73（1H，d，7.6 Hz），6.84（1H，d，7.6 Hz），6.85（1H，bs），6.94（1H，d，7.6 Hz），7.10（1H，d，7.6 Hz），7.18（1H，bs），7.66（1H，d，16.0 Hz）；13C-NMR（400 MHz，D2O）δ：16.52，34.59，60.73，65.19，68.92，69.98，70.07，70.13，70.59，71.84，72.64，74.19，97.04，98.93，113.85，115.09，115.86，116.11，116.49，121.03，122.76，126.76，131.25，142.24，143.79，144.18，146.69，147.16，186.70。以上数据与文献［20］一致，确定为magnoloside A。

3 讨论与结论

厚朴具有多种药理作用，而magnoloside A 被认为是其活性成分之一，故建立其高效的分离制备方法具有重要意义。本实验采用HSCCC 法对magnoloside A 进行分离纯化，它相比于制备液相色谱对样品前处理要求低，经简单的回流提取和萃取富集后即可进样，省去了文献报道的柱层析前处理操作，极大简化了流程，提高了效率。

在HSCCC 分离研究中，本实验对两相溶剂系统、流动相体积流量、仪器转速、体系温度、进样量等参数进行了系统考察，发现在两相溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1∶1∶0.2∶2）、转速850 r／min、体积流量3 mL／min、温度45 ℃条件下，固定相保留率高达73.3%，为后续实际样品的高效分离奠定了基础。

同时，HSCCC 法样品前处理步骤简单，分离制备1 次仅需270 min，单次进样量达1 g，可制备得纯度为95.8%的magnoloside A 121.9 mg，逆流分离纯化回收率达81.7%，方法总回收率为65.0%。该方法具有操作简便、节省时间药材、产率和回收率高等特点，可大大降低分离成本，为该成分高效制备提供了新方法。