MicroRNAs在酒精性脂肪肝形成机制中的作用研究进展

左志华，姜瑶，樊佳，陶华林*，郭永灿*

1西南医科大学附属医院检验科，四川泸州 646000；2西南医科大学附属中医医院检验科，四川泸州 646000

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指长期大量饮酒后，肝细胞发生脂肪变性等一系列病理变化，可向脂肪性肝纤维化演变[1-2]，最终导致脂肪性肝硬化[3]。目前对AFLD形成机制的研究主要包括脂质代谢异常、免疫炎症反应、肠道菌群失调等途径，其中大部分研究停留在AFLD组织细胞层次，其分子机制尚不清楚，且AFLD缺乏早期诊断标志物，严重阻碍了本病的诊断及治疗[4]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类大小为20～25 bp的非编码RNA，主要通过与mRNA 3'-UTR区域完全或非完全配对，引起mRNA翻译受抑或降解[5]，从而导致机体内蛋白质水平发生改变[6]。近年来研究证实，miRNAs在AFLD中参与调节脂质转运及代谢，同时对AFLD中相关蛋白的表达水平具有重要影响[7]。因此了解miRNAs在AFLD形成中的作用，可能是研究AFLD发病机制及发现潜在治疗靶点的重要方向。本文对近年来发现的参与AFLD形成机制中相关信号通路基因的miRNAs进行综述，阐释miRNAs在AFLD中的作用。

1 参与调控脂肪肝形成的miRNAs

正常肝细胞主要负责脂肪的消化吸收、合成转运及运输等过程，而脂肪肝主要表现为肝细胞发生脂肪变性，脂肪异常累积过多。大量研究证实，miRNAs在脂肪肝的形成中起重要作用(表1)。如miR-21在非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)中通过靶向抑制基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)来调节肝细胞中三酰甘油与胆固醇的代谢[8]，而miR-149作用的靶基因是肝细胞内重要的脂质调节因子——成纤维细胞形成因子-21(fibroblast growth factor-21，FGF-21)，它可以负性调控FGF-21蛋白的表达水平[9]。

此外，肝细胞炎症及凋亡也是促进脂肪肝形成的重要因素。早期研究证实，miR-155及miR-26b通过调节肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)来促进肝细胞炎症进展[10-11]，且miR-155还可以通过直接靶向抑制肝X受体α(liver X receptor α，LXRα)而诱导胆固醇调节元件结合蛋白-1(sterolregulatory element binding protein 1，SREBP-1)的高表达，进而促进肝细胞内脂代谢及脂质的积累[12]。同时Zhao等[13]通过小鼠实验证实了miR-200a可作用于靶基因E盒锌指结合蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)，从而介导脂肪肝细胞的凋亡。

表1 miRNAs在脂肪肝中的调控通路与作用机制Tab.1 Regulatory pathways and mechanisms of miRNAs in fatty liver

2 miRNAs参与AFLD形成的机制

AFLD与NAFLD的形成机制存在共同之处，包括许多脂质转录因子与疾病发展的相关途径，如NAD-依赖性的去乙酰化酶1(sirtuin 1，SIRT1)、过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)、叉头框蛋白O1(human forkhead box protein O1，FOXO1)、胰岛素抵抗途径等[33]。在AFLD中，乙醇不仅能直接对肝细胞产生毒性作用，引起脂质代谢紊乱，同时还能刺激肝脏免疫细胞的激活及肠道屏障功能的失效，并通过介导炎性介质的改变导致肝细胞炎症。大量动物实验及细胞实验通过基因芯片技术证明AFLD对miRNAs的表达具有明显的调节作用。例如，Dolganiuc等[34]通过微阵列分析了乙醇喂养小鼠肝脏中miRNAs的表达情况，结果显示，miR-27b、miR-214、miR-182表达下调，miR-705、miR-1224表达上调。Stickel等[4]对35例酒精性肝炎患者进行研究发现，包括miR-182等111种miRNAs表达上调，miR-21、miR-155、miR-214等66种miRNAs表达下调。

2.1 miRNAs通过参与调控脂质代谢促进AFLD形成 在AFLD形成过程中，脂质代谢异常起关键作用。乙醇能够影响细胞内的氧化还原状态，干扰脂质代谢通路中重要的脂质转录因子，引起脂质代谢异常。有研究显示，乙醇主要通过抑制中枢信号分子SIRT1来影响脂质代谢[35]，SIRT1的主要功能是对脂质转录因子(如FOXO基因家族)进行去乙酰化修饰，使转录因子与DNA的结合更加紧密，促进

DNA的转录，参与脂质代谢。因此，miRNAs可通过调控SIRT1脂质代谢信号通路中重要的靶基因，如脂素-1(Lipin-1)、SREBP-1、PPARα、PPARγ共激活剂-1α(PPARγ co-activator-1α，PCG-1α)等，在AFLD的形成中发挥重要作用。

2.1.1 miR-217、miR-203靶向作用于Lipin-1而调节脂肪氧化合成 Lipin-1在脂质代谢中具有双重功能，在细胞质中调节三酰甘油合成，同时在细胞核中能够调节肝脏的脂肪酸氧化能力及脂肪生成酶的活性[36-37]。之前有研究者通过建立体外肝细胞乙醇培养模型及乙醇喂养的小鼠模型，发现miR-217水平随着乙醇浓度增加而上升，且过表达的miR-217可下调SIRT1基因的表达，明显提高转录因子Lipin-1的表达水平，促进脂肪的积累[14]。然而在小鼠体内，miR-203的高表达可靶向抑制Lipin-1的表达，从而减轻脂肪的积累[15]。

2.1.2 miR-24通过SIRT1/SREBP-1途径参与脂质代谢 在肝细胞中，乙醇可通过SIRT1信号通路诱导SREBP-1去乙酰化，从而抑制SREBP-1基因表达，导致胆固醇合成酶及三酰甘油合成酶的激活受阻[38]。有实验通过乙醇喂养小鼠发现，miR-24的低表达可以引起SIRT1的上调，进而抑制SREBP-1的表达，最终导致脂肪积累[16,39]。在NAFLD中，许多miRNAs被证实参与了SREBP-1调节脂质代谢的过程[16]，但在AFLD中，仍需要不断地研究、发掘miRNAs参与SREBP-1调节的机制。

2.1.3 miR-34a、miR-27a通过抑制PPARα的表达调节脂质氧化代谢 PPARα信号通路在AFLD脂质氧化代谢中也起着重要的作用。在乙醇的诱导下，PPARα可通过脂肪酸β氧化、三羧酸循环及电子转移链三条途径增强线粒体中的氧化代谢反应，调节AFLD脂质代谢[40]。同时生物钟基因BMAL1增强肝细胞的抗乙醇损伤能力也与PPARα介导的脂肪氧化有关[41]。实验研究证实，miR-34a、miR-27a可以通过抑制靶基因PPARα的表达来调节脂质的转运与代谢[17-18]。

2.2 miRNAs参与细胞免疫炎症反应促进AFLD形成 在肝脏中存在许多天然免疫细胞，包括单核巨噬细胞及库普弗细胞等，形成了天然的免疫防御屏障，乙醇可通过激活免疫细胞介导的细胞炎症反应促进AFLD的形成。在乙醇诱导的致敏反应中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)起着关键作用，可与肝组织细胞及库普弗细胞表达的Toll样受体信号(toll-like receptors，TLRs)结合，激活炎症反应途径，产生炎性细胞因子(如NF-κB)、补体等，同时还可通过AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等信号通路促进AFLD的形成[42-44]。

2.2.1 miRNAs调控巨噬细胞与单核细胞活化在AFLD中，巨噬细胞与单核细胞在促进细胞炎症中发挥着重要作用。巨噬细胞中TLRs可诱导miR-155、miR-9、let-7c等靶向作用于编码关键分子的

mRNAs，参与调节巨噬细胞的极化[20-21]。最近研究发现，miR-155在AFLD中还可通过参与巨噬细胞自噬活动及外泌体分泌来诱导细胞炎症[45]。同时在单核细胞中，miR-27a通过下调EPK信号通路抑制快速发育生长因子同源蛋白2(sprouty2)蛋白的表达，增加白细胞介素(IL)-10的分泌，促进乙醇诱导单核细胞活化与极化的过程[22]。

2.2.2 miR-148a、miR-122、miR-223参与炎性因子的调节 在肝细胞中，miRNAs可通过AFLD中重要的炎性基因来发挥作用，如FOXO1、粒状头样2(grainyhead like2，GRHL2)。乙醇可抑制肝细胞中炎性基因FOXO1以促进miR-148a高表达，导致肝细胞发生炎性萎缩[23]。与非乙醇喂养的对照小鼠相比，乙醇喂养小鼠的炎性因子GRHL2表达水平明显上升，抑制了miR-122的表达，减轻了肝细胞的炎症反应[24]，另一项研究证实miR-223可通过抑制中性粒细胞IL-6-p47phox-氧化应激途径而明显减轻小鼠的酒精性肝损伤[25]。

2.2.3 miR-497、miR-182调节胆汁酸代谢 胆汁酸代谢异常也是引起AFLD炎症反应的因素之一。小鼠模型证实miR-497可抑制CB1R-BTG2-YY1信号通路中基因的表达，引起胆汁酸的异常代谢[26,46]。此外，在酒精肝细胞中miR-182表达明显异常，经过整合分析发现，miR-182高表达能刺激胆汁淤积，引起肝脏炎性变化，促进AFLD的形成[27]。

2.3 miRNAs参与其他路径促进AFLD形成 长期饮酒不仅能直接引起肝脏脂质代谢异常及炎性变化，还能通过其他途径促进AFLD的形成。在乙醇的刺激诱导下，肠上皮细胞可通过表达miR-212抑制闭锁小带蛋白1(zonula occludens protein 1，ZO-1)的表达，导致肠道对LPS等炎性物质的通透性增加，最后经门静脉到达肝脏，激活免疫信号通路[28,42]。长期饮酒还会限制肝脏脂肪酸氧化途径中的关键酶AMPK的活性，进而影响AFLD的形成。研究表明，AMPK可通过影响其下游元件的活性，刺激miR-15a、miR-128及miR-192的表达，介导细胞的衰老及凋亡[29]。同时AMPK还能调节miR-184的表达而影响胰岛细胞的功能，间接影响脂质的积累[10,30]。另一项研究显示，在乙醇代谢中，miR-214-3p能够抑制细胞色素P450 2E1 (CYP2E1)的表达，产生活性氧、乙醛等物质引起细胞炎性损伤[31]。同时长期饮酒使肝损伤后的肝细胞增殖再生能力减弱，这也是促进AFLD发展的潜在因素[28]。在对乙醇喂养小鼠进行肝部分切除术的实验中发现，抑制肝细胞内miR-21的水平能够有效加强肝细胞的再生能力[32]，这或许是一种新的改善AFLD的途径。

总之，目前大多数研究主要是通过构建实验动物模型或体外细胞实验阐释miRNAs与AFLD形成的关系，这些体外细胞培养及动物模型与人体组织细胞存在较大差异，不能真实反映体内的变化，但可以证实其作用机制，为今后的相关实验及治疗提供参考。因此，对于miRNAs参与AFLD形成机制的研究，需要更多基因组及蛋白质组学分析阐释miRNAs与下游因子调控作用的具体机制，完善miRNAs与靶基因作用的关系网络，再结合临床试验研究，最终使miRNAs靶向治疗成为现实。