HMGB1与重症中暑大鼠凝血紊乱的相关性分析

余保军，王黎，彭娜，施学智，陆勇，梁泳欣，童华生*，苏磊*

1南方医科大学附属深圳宝安医院重症医学科，广东深圳 518101；2解放军南部战区总医院重症医学科/全军热区创伤救治与组织修复重点实验室，广州 510010

重症中暑(severe heatstroke)是由热暴露导致的一种重症疾病，常并发凝血紊乱，最终导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率高达40%～70%[1]。凝血紊乱对重症中暑预后具有重要的预测价值[2-3]，在重症中暑发生发展中起重要作用。近年来，细胞外高迁移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)作为一种重要的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)分子，在重症中暑中的作用越来越受到重视[4-6]。研究发现，HMGB1可作用于多种细胞受体并促进细胞分泌炎性因子，加快炎症进展，进而导致内皮细胞损伤、激活凝血，还可作用于细胞受体直接促使血管内皮细胞及单核细胞分泌启动外源性凝血途径的组织因子(tissue factor，TF)[7]，提示HMGB1在重症中暑凝血紊乱中起重要作用。本研究探讨了HMGB1与重症中暑大鼠凝血紊乱的相关性，为进一步研究HMGB1参与重症中暑凝血紊乱的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)检测试剂盒(法国Stago公司)；HMGB1、凝血酶抗凝血酶复合物(TAT) ELISA检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。高温气候人工培养箱(宁波戴维医疗器械股份有限公司)；STA全自动凝血检测仪(法国Stago公司)。

1.2 实验动物 SPF级雄性SD大鼠48只，体重265～290 g，由南方医科大学动物实验中心提供，南部战区总医院动物中心饲养，自由进食、进水。实验动物的相关方案通过实验动物伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 模型制备及实验分组 采用高温气候人工培养箱建立重症中暑大鼠模型。将48只SD大鼠依据随机数字表法分为假加热正常对照组(Sham组)和重症中暑复温0 h组(HS-0 h组)、3 h组(HS-3 h组)、6 h组(HS-6 h组)、9 h组(HS-9 h组)、12 h组(HS-12 h组)、18 h组(HS-18 h组)、24 h组(HS-24 h组)，每组6只。Sham组大鼠置于温度(25.0±0.5) ℃、湿度50%±5%环境中；重症中暑组大鼠置于高温气候人工培养箱中[温度(39.5±0.2) ℃，湿度60%±5%]，禁食禁水，每10 min经直肠测核心体温(core body temperature，Tc)，Tc达43 ℃即判定为重症中暑[5]，中暑发生后立即将大鼠移出培养箱，自由进食进水，放回原饲养环境。制模前后称重，并记录热暴露时间。Sham组大鼠接受相同处理，不接受热打击。

1.3.2 血液标本采集 腹腔内注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，分离右侧颈总动脉，置入6 cm PE50导管，EDTA抗凝管采血1 ml送检血小板计数(platelet，PLT)，枸橼酸钠抗凝管采血3管，每管2 ml，1管送检常规凝血指标，其余2管4 ℃、1500 r/min离心10 min，分离血浆，分装后-80 ℃保存，集中检测。

1.3.3 PLT检测 采血后1 h内送南部战区总医院检验科，使用自动血液细胞分析仪检测。

1.3.4 PT、APTT、TT及Fib检测 采用凝固法检测PT、APTT、TT、Fib。采血后1 h内送南部战区总医院检验科，使用STA全自动凝血检测仪检测。

1.3.5 HMGB1及TAT水平检测 ELISA法检测HMGB1及TAT水平。按照ELISA检测试剂盒的说明书步骤，使用酶标仪测定450 nm波长处的光密度(OD)值，计算靶蛋白水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0和Empower (R)软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；相关分析采用广义相加模型(generalized additive model，GAM)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 中暑前后大鼠体重和核心体温变化情况 重症中暑大鼠建模前后体重及核心体温变化情况见表1。建模前，Sham组与中暑组大鼠体重差异无统计学意义(P＞0.5)。建模后，中暑组大鼠体重较建模前明显降低[下降(26.48±5.38) g，P＜0.05]，而Sham组大鼠体重下降不明显，两组体重变化差异有统计学意义(P＜0.001)。与Sham组比较，中暑组大鼠建模后的核心体温变化差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 中暑后大鼠常规凝血指标动态变化情况 大鼠中暑后PT延长。与Sham组比较，中暑后3 h、12 h PT延长，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.001)；中暑后18 h、24 h PT仍延长，但差异无统计学意义(P＞0.05，图1A)。大鼠中暑后APTT延长。与Sham组比较，中暑即刻及3 h APTT延长，差异有统计学意义(P＜0.001)；中暑后12 h APTT达高峰(P＜0.001，图1B)。与Sham组比较，大鼠中暑即刻TT延长，差异有统计学意义(P＜0.001)；中暑后9 h、12 h TT明显延长，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，图1C)。大鼠中暑后Fib水平逐渐升高，中暑后18 h达高峰(P＜0.001，图1D)。PLT在大鼠中暑后3 h开始逐渐减少。与Sham组比较，中暑后6 h PLT减少(P＜0.05)；中暑后9 h、12 h、18 h和24 h PLT明显减少(P＜0.01，P＜0.001，图1E)。

表1 建模前后大鼠体重及核心体温变化情况()Tab.1 Changes of rat's body weight and core temperature before and after modeling ()

表1 建模前后大鼠体重及核心体温变化情况()Tab.1 Changes of rat's body weight and core temperature before and after modeling ()

Tc.核心体温

项目 Sham组(n=6) 重症中暑组(n=42) P体重(g)建模前 271.83±13.30 272.22±19.22 0.993建模后 266.17±13.98 245.29±19.61 0.016体重变化 5.67±2.25 26.48±5.38 0.000热暴露时间(min) 0 170.50±8.01 0.000 Tc(℃)建模前 36.67±0.26 36.62±0.28 0.697建模后 36.76±0.23 43.00±0.00 0.000 Tc变化 0.10±0.35 6.38±0.28 0.000

2.3 中暑后大鼠血浆TAT及HMGB1水平的动态变化 大鼠血浆TAT水平于中暑后3 h开始升高，与Sham组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；中暑后9 h及12 h TAT水平明显升高(P＜0.001)，且在中暑后12 h达高峰(图2A)。中暑后，大鼠血浆HMGB1水平逐渐升高。与Sham组比较，中暑后3 h、6 h、9 h、12 h HMGB1水平明显升高(P＜0.001)，中暑后18 h及24 h HMGB1水平仍高于Sham组，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，图2B)。

2.4 中暑后大鼠血浆HMGB1与各凝血指标的相关性 广义相加模型分析结果显示，HMGB1与PT、TAT均呈线性关系且明显相关(P＜0.05，P＜0.0001，图3A、E)；HMGB1与APTT、TT均呈线性关系，但差异无统计学意义(P=0.058，P=0.096，图3B、C)；HMGB1与PLT呈非线性关系，但明显相关(P＜0.001，图3D)；HMGB1与Fib无关(P＞0.05)。

3 讨 论

中暑并发的凝血功能紊乱一直是中暑的热点话题[8]，且是中暑预后的一个重要评估指标[2-3,9]，可能是将来改善中暑预后的一个治疗靶点，但目前中暑引发机体凝血功能紊乱的机制尚未明确。

图1 各组大鼠常规凝血指标动态变化比较Fig.1 Comparison of PT, APTT, TT, Fib and PLT in rats of every group

图2 各组大鼠血浆TAT及HMGB1水平比较Fig.2 Comparison of blood plasma concentration of TAT and HMGB1 in rats of every group

图3 HMGB1与各凝血指标的相关性Fig.3 Association between HMGB1 and other coagulation parameters

本研究结果显示，大鼠中暑后24 h内PT、APTT、TT延长，PLT进行性减少，Fib水平升高，TAT(表示体内凝血酶激活程度)水平明显升高，说明中暑大鼠发生凝血功能紊乱。大鼠中暑即刻TT明显延长，是中暑大鼠最早出现异常的凝血指标。TT可反映加入足够外源性凝血酶后，将血浆Fib转变为纤维蛋白所需的时间。TT延长提示：①血浆Fib出现异常，一方面可能是Fib水平降低；另一方面也可能是Fib水平未降低，但质量出现异常或是出现能与Fib结合的异常物质。②Fib未出现异常，但机体血浆中出现大量抗凝血酶物质导致凝血酶不能作用于Fib。Fib检测结果显示，中暑即刻(HS-0 h组)Fib水平未降低，推测TT延长可能是由于中暑后血浆中出现大量抗凝血酶物质，也可能是血浆中Fib由于热打击导致质量改变或出现与Fib结合的异常物质。同时结合PT及APTT检测结果(中暑即刻APTT延长，PT未延长)，推测Fib本身出现异常的可能性较小，原因为如Fib出现异常，则PT和APTT均应延长。由此可见，大鼠中暑后血浆中即刻出现大量抗凝血酶物质导致TT和APTT延长，这与在应用肝素抗凝时观察到的凝血指标改变类似[10]。以上推测在Bouchama等[11]的研究中得到证实，即狒狒中暑即刻，血浆抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ，ATⅢ)活性较Sham组升高，但在3 h后进行性下降。本研究结果显示，中暑3 h后，大鼠TAT水平呈进行性升高，PLT进行性减少，PT、APTT均在3 h后延长、12 h达到高峰，TT在12 h延长并达到峰值。提示中暑后3 h内，机体内存在的保护性抗凝物质增多，抗凝及促凝平衡向抗凝倾斜，检测指标表现的低凝为抗凝物质导致的低凝；3 h后，抗凝物质减少，体内抗凝及促凝平衡向促凝倾斜，TAT升高代表体内凝血激活，导致凝血因子及血小板消耗致消耗性低凝，检测指标表现的低凝为消耗性低凝。虽然如此，但检测发现血浆Fib水平并未进行性减低，考虑是由于Fib是一种急性反应蛋白，在发生炎症反应、创伤、应激时会升高，而热打击可引起机体创伤，导致严重的炎症反应，因此中暑后大鼠血浆Fib水平升高是机体对热应激的反应，结合中暑后12 h TT延长，提示Fib存在功能异常或血浆中存在与Fib大量结合的物质[12]。

HMGB1早期是作为晚期炎性介质参与脓毒症发病被发现的，是内毒素致死效应的重要晚期因子，抑制HMGB1活性或分泌可减少大鼠重症脓毒症和多脏器衰竭(MOF)的发生[13]。有研究发现，血浆HMGB1水平在中暑即刻显著升高并可长时间维持，从而发挥早期启动并动态维持炎症效应的功能，可作为中暑预后不良的预测指标[6,14]。本研究显示，与Sham组相比，大鼠中暑即刻HMGB1水平升高，3 h显著升高，12 h达高峰，24 h仍高于对照组。由于HMGB1可作用于多种细胞受体[包括晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)、Toll样受体(TLR2、TLR4、TLR9)]发挥生物学效应，直接促使血管内皮细胞及单核细胞分泌炎性因子并激活外源性凝血途径的组织因子(TF)[7]，因此，HMGB1可通过炎症途径和外源性凝血途径激活机体凝血，从而导致中暑凝血紊乱。本研究中曲线拟合相关分析结果显示，HMGB1与凝血相关指标PT、PLT、TAT明显相关，尤其与TAT存在明显的线性相关。基于HMGB1在中暑后水平升高并长时间维持高水平，可直接刺激细胞TF合成，以及促进炎性因子释放的特点，且HGMB1与大鼠中暑后凝血紊乱指标明显相关，提示HMGB1在重症中暑大鼠凝血紊乱中发挥重要作用。

综上所述，HMGB1与重症中暑大鼠凝血紊乱明显相关，但其具体作用机制尚需进一步研究。