三结构域蛋白14在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

倪晨明 郑楷炼 潘亚奇 倪灿荣 金钢

1海军军医大学附属长海医院胰腺外科，上海 200433；2海军军医大学附属长海医院病理科，上海 200433

胰腺癌为早期症状隐匿、疗效不佳、预后极差的高度恶性肿瘤，我国胰腺癌患者约占恶性肿瘤病例数的2.42%，且发病率呈现上升趋势，严重威胁着患者的生命安全[1]，因此深入研究胰腺癌的发病机制，有助于胰腺癌早期诊断、延缓肿瘤发展和为治疗提供精准化靶点。三结构域蛋白 14(tripartite motif 14，TRIM14)与肿瘤的生物学行为和临床病理特征之间存在密切的关系，在肿瘤的血管生成和癌细胞转移及凋亡抵抗中起到关键作用[2-3]。研究发现TRIM14可显著激活NF-κB信号通路[4-5]，而NF-κB信号通路为胰腺癌发生、发展中的关键核心途径[6]。目前TRIM4在胰腺癌中的表达意义尚不明确，其表达与NF-κB信号通路活化关系也不清楚。本研究通过检测胰腺癌组织TRIM14、磷酸化p65(phosphorylation p65, P-p65)及NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、血管内皮细胞生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表达，分析TRIM14与NF-κB的关系，探讨TRIM14在胰腺癌发生发展中的作用机制。

资料与方法

一、临床资料及组织标本

收集2016年1月至2018年12月间海军军医大学附属长海医院胰腺外科176例行手术切除且病理确诊的胰腺癌患者癌组织及其对应的癌旁组织(距离病灶3 cm处的正常胰腺组织)标本。其中男性95例，女性81例，年龄42～73岁，平均63岁。参考美国国立综合癌症网2011年中文版胰腺癌指南中TNM分期标准，Ⅰ期41例、Ⅱ期83例、Ⅲ期52例；根据病理分级，低分化46例、中分化79例、高分化51例。纳入患者术前均无放疗、化疗、生物治疗等治疗史，患者及家属均签署知情同意书。术后通过定期门诊复诊或电话随访获取病例的复发时间及总生存时间，随访时间截至2019年5月。176例胰腺癌及对应癌旁组织经手术切除后，置于4%甲醛溶液固定并石蜡包埋备用，其中12例手术切除后迅速放入液氮冻存。

二、胰腺癌及对应癌旁组织TRIM14蛋白表达检测

组织石蜡标本制作成4 μm切片，采用免疫组织化学染色法检测组织TRIM14蛋白表达，按试剂盒说明书操作。兔抗人TRIM14多克隆抗体购于英国abcam公司，工作浓度1∶1 000；多聚物抗兔、鼠IgG-HRP二抗购于北京中杉金桥公司，工作浓度1∶5 000，最后DAB显色，苏木素复染。以已知阳性的人肝组织为阳性对照，用PBS代替一抗为阴性对照，以胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。由两位病理科医师分别镜下阅片，针对TRIM14染色强度及范围进行评分[5]。染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色范围评分：<5%为0分，5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。两项评分的乘积为总评分，1～3分为弱阳性，4～7分为中度阳性组，8分及以上为强阳性[7]。

三、胰腺癌组织TRIM14、P-p65蛋白表达检测

取液氮冻存胰腺癌组织50 mg，碾磨成粉末状，使用RIPA裂解液裂解组织，抽提总蛋白。采用BCA试剂盒定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测TRIM14、P-p65表达水平。小鼠抗人P-p65、小鼠抗人p65及小鼠抗人β-actin单克隆抗体均购自Cell Signal公司，工作浓度为1∶1 000，TRIM14一抗、二抗及其工作浓度同上。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。应用Bio-Rad 公司的全自动凝胶成像系统扫描蛋白条带，以目的条带与内参(β-actin)条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

四、胰腺癌组织Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表达检测

取液氮冻存胰腺癌组织，解冻后采用Trizol提取组织总RNA，紫外分光光度仪法测定RNA纯度及浓度。先将RNA逆转录为cDNA，按反转录试剂盒说明书操作。再用荧光定量PCR法检测组织Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表达，荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa公司。Bcl-xl正向引物为5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，反向引物为5′-TCCATCTCCGATTCGTCCCT-3′；CCND1正向引物为5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，反向引物为5′-CCCCTTCGCACACATTTGAA-3′；VEGF-C正向引物为5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物为5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′。以β-actin作为内参。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。PCR反应条件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环，72℃延伸5 min，4℃ 5 min。由PCR仪自带软件获取Ct值，按公式2-△△Ct计算目的基因mRNA表达量。

五、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织TRIM14蛋白表达

TRIM14蛋白主要定位于胞质中(图1)。176例癌组织中TRIM14蛋白表达阴性23例(13.1%)，弱阳性39例(22.2%)，中度阳性73例(41.4%)，强阳性41例(23.3%)；癌旁组织分别为128例(72.7%)、26例(14.8%)、17例(9.7%)、5例(2.8%)。胰腺癌组织TRIM14蛋白表达总阳性率为86.9%，显著高于癌旁组织的27.3%，差异有统计学意义(χ2=127.846，P=0.000)。

二、胰腺癌组织TRIM14表达水平与肿瘤临床病理参数的关系

将TRIM14阴性和弱阳性表达患者归为低表达组，中度阳性和强阳性表达患者归为高表达组。结果显示，胰腺癌组织TRIM14表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移及浸润深度均呈显著相关，而与患者性别、年龄、肿瘤分化程度及远处转移无明显相关性(表1)。

注：TRIM14为三结构域蛋白14图1 胰腺癌(1A)及癌旁组织(1B)TRIM14蛋白表达(免疫组织化学染色 × 200)

表1胰腺癌组织TRIM14表达水平与肿瘤临床病理参数的关系(例)

临床病理参数TRIM14蛋白表达低表达组(62例)高表达组(114例)χ2值P值性别 男35600.2360.372 女2754年龄(岁) ≤6529362.1240.998 >653366分化程度 高17340.1420.931 中2851 低1729临床分期 Ⅰ期291235.7040.000 Ⅱ期2756 Ⅲ期646浸润深度 T1201865.7600.000 T21720 T31532 T41044远处转移 无53940.2680.386 有920淋巴结转移 无30364.8410.021 有3278

注：TRIM14为三结构域蛋白14

三、胰腺癌组织TRIM14表达水平与患者预后间的关系

单因素分析结果显示，影响胰腺癌患者无瘤生存期的因素包括肿瘤分化程度、有无淋巴结转移及TRIM14表达水平，影响总生存期的因素包括肿瘤分化程度、临床分期、远处转移及TRIM14表达水平(P值均<0.05，表2)。多因素分析结果显示，影响胰腺癌患者无瘤生存期的因素包括肿瘤分化程度和TRIM14表达水平，影响总生存期的因素包括肿瘤远处转移及TRIM14表达水平(表2)。由此可见，TRIM14蛋白高表达是胰腺癌患者无瘤生存期和总生存期的独立危险因素。

四、TRIM14表达水平与NF-κB信号通路活化的关系

12例胰腺癌组织TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表达水平见表3。胰腺癌组织TRIM14与P-p65表达的变化趋势较为一致(r=0.86，P<0.01，图2A)，即高表达TRIM14的胰腺癌组织的p65磷酸化程度也较高，提示NF-κB激活。胰腺癌组织NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表达水平也与TRIM14表达有较高的一致性(r值分别为0.85、0.91、0.92，P值均<0.01，图2B)，进一步表明TRIM14高表达与癌细胞NF-κB激活有明显关系。

讨 论

近年来研究报道指出，TRIM家族在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。TRIM14基因为其家族成员之一，定位在人的9q22号染色体上，蛋白结构包括1个卷曲螺旋域、1个B-box结构域和1个C端PRYSPRY结构域。Zhuang等[8]研究指出TRIM14过表达可加速细胞周期，通过PI3K/AKT信号通路影响细胞的有丝分裂过程。杜天明等[9]研究发现TRIM14在胃癌组织高表达，可能参与胃癌恶化的过程。白明辉等[10]发现TRIM14在胰腺癌组织中也高表达，且与胰腺癌的发生、发展及癌细胞侵袭能力之间有着密切关系，TRIM14表达水平越高，患者的预后越差。本研究结果显示，TRIM14在胰腺癌组织高表达，与上述报道基本相符。进一步分析TRIM14表达水平与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系，结果显示，TRIM14表达水平与肿瘤临床分期、浸润深度和淋巴结转移等恶性病理特征显著相关，提示 TRIM14可能参与了胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的调控。Cox回归分析结果显示，影响胰腺癌患者无瘤生存期的因素包括肿瘤的分化程度和TRIM14的表达水平，影响总生存期的因素包括肿瘤远处转移及TRIM14的表达水平，可见TRIM14高表达是胰腺癌患者无瘤生存期和总生存期的独立危险因素。

表2 与胰腺癌患者无瘤生存期和总生存期相关风险因素的分析

注：TRIM14为三结构域蛋白14

表3 12例胰腺癌组织TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA的表达水平

注：TRIM14为三结构域蛋白14；P-p65为磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1为细胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C为血管内皮生长因子-C

注：TRIM14为三结构域蛋白14；P-p65为磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1为细胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C为血管内皮生长因子-C

图212例胰腺癌组织TRIM14表达水平与P-p65/p65比值(2A)及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表达水平(2B)的相关性

TRIM14在肿瘤发生中的作用机制报道较少， Su等[4]研究发现，过表达TRIM14可通过激活NF-κB信号通路增强细胞的侵袭性。本研究发现，TRIM14表达水平与NF-κB信号通路激活状态呈正相关，提示TRIM14可能通过活化NF-κB信号通路促进癌症发生。进一步的调控机制尚需在体外细胞实验中得到验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突