金鱼草rosea1基因在陆地棉中的功能分析

聂园军，张换样，李静，吴慎杰，朱永红，焦改丽，秦丽霞*

(1.山西省农业科学院 资源与经济研究所，山西 太原 030031；2.山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城 044000)

棉花是世界上重要的纤维作物之一，彩色棉纤维具有天然色彩、穿着舒适等优点[1]。随着当今社会人们对环境和健康的日益关注，利用基因工程技术在不改变品质和产量的前提下改变白色棉纤维色泽和直接改良彩色棉纤维品质已成为研究热点[2]。

Humphries等将编码富含WD重复结构的转录因子GhTTG1和GhTTG3基因转入紫罗兰ttg1突变体中，在其白色花瓣上出现明显的紫色花青素斑点，暗示棉花GhTTG1和GhTTG3基因与花青素的合成相关[3]。Xu等将修饰改造过的控制黑色素合成基因dtyrA和dORF438导入棉花，产生了棕色纤维[4]。最近有报道GhTT2_A07基因参与调控不易燃的陆地棉品种Lc1棕色棉纤维的合成[5]。随后，Xu等报道2个TT-Ⅱ型MYB转录因子参与调控四倍体陆地棉花青素的生物合成[6]。

参与花青素合成调控的转录因子可分为3大类: MYB类转录因子、bHLH类转录因子和WD40类转录因子[7～18]。在大多数植物中，这3类转录因子通常以蛋白复合体的形式直接或间接调控花青素的合成[15～18]。金鱼草花中有3个控制花冠着色强度和颜色差异的R2R3型MYB类转录因子，分别为ROSEAl(Ros1)、ROSEA2(Ros2)和VENOSA(Ve)，控制金鱼草花色产生天然变异。rosea位点会引起花青素更多的表型改变，直接调控结构基因的转录，特别是调控植物组织表皮内外间花青素的分布和变化。rosea1促进色素积累增加[19]。Butelli等[19]将金鱼草中编码bHLH类转录因子的delila基因和编码MYB类转录因子的rosea1基因一起导入番茄，导致番茄变为紫色，花青素含量明显增高，证明了这2类转录因子协同作用可以得到更好的效果。

本研究将控制金鱼草花青素合成基因rosea1导入白色陆地棉中，获得转基因棉花植株，对其外源基因进行了表达分析和功能验证，并检测了其亚细胞定位特征，为深入研究rosea1在棉花中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

豫早1号(YZ-1)棉花种子经70%乙醇表面消毒1 min，30% H2O2处理2 h，后经无菌水冲洗3～4次，浸泡过夜，待种子根尖露白播种于1/2 MS培养基上，萌发的无菌幼苗培养5～7 d后用于棉花遗传转化试验。

1.2 ROSEA1的亚细胞定位分析

在rosea1基因的开放阅读框ORF两端设计基因特异性引物(表1)，两端分别加上特异性限制性酶切位点，扩增rosea1基因的ORF产物先连接至克隆载体pSK上进行测序后，将目的基因片段经酶切连接至表达载体pBI121-eGFP中，获得pBI121-rosea1-eGFP质粒，转入农杆菌菌株LBA4404中，经PCR检测筛选阳性菌株。

采用农杆菌介导法将携带有目的基因的融合表达载体转入棉花下胚轴中进行诱导培养2～3个月，每隔1个月继代1次。挑取少量新鲜的棉花愈伤组织于含有500 mL磷酸缓冲液(PBS)的1.5 mL ep管中，将样品用PBS稀释后制片，置于共聚焦显微镜下观察荧光信号，并拍照。

1.3 rosea1过量表达载体的构建与棉花遗传转化

根据Butelli等提供的携带有2个目的基因的载体pJB1[19]，设计接头引物(表1)，加上attB接头后，运用Gateway®技术构建过量表达载体即为所需载体。将rosea1基因分别运用BP-LR反应将其cDNA的开放阅读框(ORF)全序列构建至CaMV35S启动子驱动表达的表达载体pGWB408上，获得pGWB408-rosea1载体(简称Ros408)。将rosea1基因的ORF序列利用BP-LR反应构建至已构建好的纤维特异启动子启动的表达载体pEX3:pGWB407上，形成pEX3:pGWB407-rosea1载体(简称Ros407)。将携带有目的基因的质粒通过电转化法转入农杆菌菌株LBA4404中，经PCR检测选取阳性克隆进行棉花遗传转化。

本试验利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法[20]，将构建好的Ros408和Ros407质粒分别转化受体材料陆地棉YZ-1, 选取的转化受体均为下胚轴。

表1 引物序列及用途

1.4 转基因阳性植株的鉴定

采用改良的CTAB法提取T0代转基因棉株和非转基因棉株的基因组 DNA，进行 PCR 分析。提取T3代3个纯合株系和对照叶片的DNA(40 μg)，用EcoR I限制性内切酶置于37 ℃酶切过夜，用0.7%琼脂糖凝胶40 V电泳分离、变性，然后将DNA转移到HybondTM-N+尼龙膜(Amersham)上。分子杂交按 Sambrook 等[21]方法进行。以nptII和rosea1基因片段作探针，采用 Promega公司随机引物标记试剂盒进行同位素[α-32P]dCTP 探针标记。

1.5 实时荧光定量PCR

用改良的CTAB法提取棉花不同组织的总RNA[22]，逆转录合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计花青素合成相关的结构基因二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)、花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR)、黄酮醇羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、查耳酮异构酶(chalcone-flavanove isomerase, CHI)的特异性引物(表1)，进行Real time PCR，每个反应设置3次重复，以棉花GhUBQ7基因(Genbank登录号AY189972)作为内参基因。

1.6 花青素含量的测定

分别称取0.3 g植物茎尖叶片、苞叶和花蕾材料，加入400 μL含1% HCl(V∶V)的甲醇，4 ℃提取过夜，上清用分光光度计读出530 nm和657 nm的吸光值，计算公式为：花青素的相对含量=A530-0.33*A657。

1.7 棉花纤维中色素的提取与测定分析

准确称取棉花纤维样品0.5 g浸泡在100 mL 70%乙醇，保存在广口瓶中，放置18 h。随后放入索氏提取器中，加入浸泡过的70%乙醇，沸水浴下蒸馏3 h至白色绒絮状。滤纸过滤，滤液定容至100 mL体积。在BECKMAN DU640可见紫外分光光度进行扫描。

2 结果与分析

2.1 ROSEA1蛋白在棉花中的亚细胞定位分析

为了确定ROSEA1转录因子在棉花细胞中的定位，构建了rosea1与eGFP基因的融合表达载体(图1)，通过农杆菌介导法转入棉花下胚轴中进行诱导培养2～3个月。愈伤组织经5% DAPI染色处理10 min后，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。结果显示，荧光信号主要分布在细胞核中(图2)，表明ROSEA1蛋白定位于细胞核。

M：DL2000；-：阴性对照；+：阳性对照；1,2：质粒PCR产物

A: 激光下的蛋白的定位；B: 明视野下的图像; C: DAPI染色；D: 染色后激光下的定位

2.2 rosea1转基因棉花的获得、鉴定和筛选

为了研究rosea1基因在棉花中的功能，运用Gateway®技术分别构建了由35S启动子驱动和纤维特异启动子pEX驱动rosea1基因表达的过量表达载体，电转化法转入农杆菌LBA4404菌株。采用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因棉花植株。利用DNA提取试剂盒对转基因棉花植株进行gDNA提取，设计目的基因的特异性引物进行PCR扩增(表1)。由图3可见，携带有目的基因的片段已整合到棉花的基因组中。选取PCR检测呈阳性的单株收获种子并加代，再经卡那霉素抗性筛选及PCR检测得到T3代纯合转基因阳性株系。

对gDNA水平上鉴定为阳性的转基因植株进行Southern blot，NPTII区域设计探针，检测目的基因的插入拷贝数。结果显示：Ros408载体中以单拷贝方式插入的有7个株系，分别是单株L2-7、L3-6、L4-8、L5-10、L10-3、L27-5和L30-1；而L28-9和L29-4株系分别为4个拷贝和双拷贝插入(图4)。Ros407载体中以单拷贝方式插入的有7个株系，分别是单株R1-4、R2-5、R3-9、R4-11、R5-1、R6-7和R27-2。而R9-8和R24-1株系分别为3个拷贝和4个拷贝插入(图4)。

荧光实时定量RT-PCR分析结果(图5A-C)显示：rosea1在Ros408转基因株系L28、L29、L30、L33的开花后15 d(Days post anthesis, DPA)纤维和L28、L30、L34叶片中均有较高量表达；rosea1在Ros407转基因株系的R23、R24、R26和R27开花后15 d纤维中均较有高量表达。

pEX3:pGWB407-rosea1(Ros407)(A)和pGWB408-rosea1(Ros408)(B)过量表达转基因棉花gDNA水平的鉴定; M: DNA Marker DL2000；-: 阴性对照；+: 阳性对照; WT: 野生型YZ-1。(A)1～15和(B)1～20分别为不同株系的转基因棉花植株

M：DNA Marker; YZ-1:野生型受体对照; 1～9：依次为Ros408过量表达转基因棉花株系L2-7、L3-6、L4-8、L5-10、L10-3、L27-5、L28-9、L29-4和L30-1；10～18: 依次为Ros407 过量表达转基因棉花株系R1-4、R2-5、R3-9、R4-11、R5-1、R6-7、R9-8、R24-1和R27-2

2.3 花青素合成相关基因在转基因棉花中的表达分析

为了进一步研究rosea1在棉花叶片色素合成及棉纤维色素沉积中的功能，选取了花青素合成相关基因DFR、ANS、CHI、F3H和ANR在转基因棉花的15 DPA纤维和叶片中进行表达分析(图5D-F)。结果显示DFR在Ros408转基因株系的15 DPA纤维中表达量显著上调(P<0.05)；DFR和ANR在Ros408转基因株系叶片中表达量明显上调；ANR在Ros407转基因株系的15 DPA纤维中表达量显著上调(P<0.05)，推测rosea1基因可能通过调控DFR和ANR基因参与花青素及纤维色素的合成。

A-C: rosea1在转基因棉花中的表达分析；D-F: 花青素合成相关基因在转基因棉花中的表达分析; A, B: rosea1在Ros408转基因棉花15 DPA纤维(A)和叶片(B)中的表达量分析; C: rosea1在Ros407转基因棉花15DPA 纤维中的表达量分析; D-E: 花青素合成相关基因在Ros408转基因棉花15 DPA纤维(D)和叶片(E)中的表达量分析; F: 花青素合成相关基因在Ros407转基因棉花15 DPA 纤维中的表达量分析

2.4 花青素和纤维色素含量的测定分析

在Ros408转基因棉花植株部分株系的茎尖叶片、花蕾、苞叶中均出现紫色(图6A-C)；在Ros407植株中未观察到可见的颜色变化。为了进一步深入研究Ros408转基因棉花植株中所观察的显著表型，分别对出现颜色变化的组织部位进行了花青素含量的测定分析，试验结果表明，在Ros408-L30植株的小花蕾和大花蕾中、茎尖的大、小叶片中、幼嫩苞叶中，花青素含量均显著升高(P<0.01)(图6D-F)，表明rosea1基因参与调控棉花中花青素的合成。

纤维色素含量测定分析显示Ros407纤维与对照相比在200～220 nm之间吸收峰有所增加，Ros407出现微弱的红移现象，而对照YZ-1则没有出现红移现象(图7)，说明Ros407有可能对纤维的色素成分造成了微弱的影响，但是并没有观察到Ros407纤维的颜色发生改变。

3 讨论与结论

已有研究表明MYB类转录因子、bHLH类转录因子和WD40类转录因子通常是2种或2种以上相互作用或共表达以后，通过与结构基因启动子上的顺式作用元件特异结合来共同调控花青素的合成[15～18]。本研究只将rosea1基因单独转入白色陆地棉中，虽在转录水平上均有不同程度的表达，但转基因棉花植株未获得彩色棉纤维植株。一方面可能是棉花彩色纤维形成及棉纤维色素积累机制与金鱼草中花青素的合成机制本身存在差异；另一方面有可能基因单独在白色棉中过量表达未能与调控纤维色素合成的结构基因启动子上的特异顺式作用元件结合，从而不能引起下游结构基因及调控基因的表达。后续计划通过遗传杂交试验获得delila基因和rosea1基因的双基因过量表达转基因棉花植株，观察植株的表型及纤维的颜色变化，进一步研究rosea1基因在棉花叶片中花青素合成及纤维色素沉积过程中的作用机理。

WT: 野生型YZ-1; Ros408-L30、-L28、-L34分别为不同株系的Ros408转基因棉花; D-F: 分别是对已观察到颜色的大、小花蕾，大、小叶片及从幼嫩到成熟时期的苞叶进行花青素含量的测定；**: 表示存在极显著差异(P<0.01)

黑色：野生型；红色和蓝色：Ros407转基因株系L27和L26

先前有研究表明编码同一蛋白的同源基因在表达强度上通常会存在差异。其异源表达时的强度与亲缘关系及与其编码蛋白的结构之间也存在一定的关联[23]。因此选择合适的基因资源对于实现植物花色、果实及其它器官、组织等色彩的分子设计至关重要。正义、反义导入外源基因都有可能会抑制花青素苷合成相关基因的表达，从而导致花色或果实等部位色彩变浅甚至出现纯白的颜色，但抑制程度是有限的，而且极有可能回补突变成野生型花色。虽然目前多个实验室已获得了不同物种的花色及果实等部位产生不同色彩的转基因植物(其中包括转基因彩色棉花)，但真正能够商品化的仅为少数，其中一个主要原因是转基因植株的色彩不能稳定遗传。不但色彩易变，而且极有可能回复突变成野生型性状，尤其不利于商业推广[15, 24]。因此，花色及果实等部位色彩性状的遗传稳定性是今后基因工程中亟待解决的关键问题之一。目前，已有实验室在开发能够携带多基因的载体[19]，未来携带多基因载体的广泛应用将会在农作物遗传改良领域中发挥巨大的作用。

本文将控制金鱼草花青素合成基因rosea1导入陆地棉中，分析表明ROSEA1蛋白定位于细胞核中。rosea1基因可以改变陆地棉品种YZ-1花蕾、茎尖叶片、幼嫩苞叶的颜色，花青素含量及纤维色素提取扫描测定分析发现rosea1可以改变陆地棉品种YZ-1花青素及纤维色素的含量。参与花青素合成相关基因DFR和ANR在转基因棉花叶片和纤维中表达量均显著上调。暗示rosea1基因参与调控棉花花青素的合成，本研究为深入分析ROSEA1转录因子的功能及分子调控机制奠定了基础。同时也为转基因彩棉的产生提供了理论依据和技术支持。