海南省黎族新生儿原发性肉碱缺乏症筛查及基因情况分析

温英梅，赵振东，王洁

本研究价值：

（1）原发性肉碱缺乏症（PCD）的发病情况存在种族差异，临床报道的发生率各不相同，埃及PCD发生率约为1∶250 000，美国PCD发生率约为1∶142 000，中国广西桂中地区PCD发生率约为1∶3 090，而海南省黎族人群PCD发病情况尚未见报。

（2）本研究采用串联质谱技术进行新生儿PCD的筛查，发现海南省黎族新生儿PCD发生率较高（1/2 295），且基因突变类型为c.51C＞G、c.760C＞T、c.338G＞A、c.428C＞T、c.1340A＞T、c.825G＞A、c.4442C＞T、c.1400C＞G，为出生人口筛查丰富数据，对避免黎族出生人口缺陷具有重要意义。

原发性肉碱缺乏症（PCD）是一种由SLC22A5基因突变导致脂肪酸β氧化缺陷的常染色体隐性遗传病［1］，该病存在种族差异［2］，临床报道的发生率各不相同，埃及PCD发生率约为1∶250 000［3］，美国PCD发生率约为1∶142 000［4］，中国广西桂中地区PCD发生率约为1∶3 090［5］，北大西洋的法罗群岛PCD发生率最高约 1∶30［6］。PCD 是一种潜在致死性疾病［7-8］，通过补充肉碱做好预防可以有效避免不良预后的发生，因此在新生儿期开展PCD筛查尤为必要。目前海南省黎族人群PCD发病情况尚未见报道，因此本研究将海南省黎族新生儿PCD筛查及基因分析情况报道如下，旨在为黎族人群该病的诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 借助海南省新生儿筛查网络平台，收集2016-08-01至2019-07-31在海南省出生的黎族新生儿22 950例，其中男11 968例，女10 982例。均采取知情同意原则，选取自愿参加新生儿多种遗传代谢病筛查研究，并签署《海南省新生儿多种遗传代谢病知情同意书》的出生3～28 d的新生儿。

1.2 样本采集及相关要求 采集新生儿足跟血滴于新生儿筛查样本采集卡上制成903&滤纸干血片。样本要求：按照中华人民共和国卫生行业标准（WS 376.3—2013）［9］要求，血斑直径≥5 mm，血斑数量3～4个，均匀渗透。晾干后立即检测，不能立即检测则密封于封口袋，置于2～8 ℃冰箱保存。

1.3 实验仪器及试剂 仪器：Waters串联质谱仪（TQD）、艾本森孵育振荡器（MicBio-Ⅳ型）、混匀器（Vortex Mixer XW-80A）以及自动打孔机（2081Panthera-PuncherTM9）。试剂：非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒（PerkinElmer，Inc.公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 试验步骤 严格按照非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒说明书进行试验操作，将自动打孔机打下的直径为3 mm血样进行萃取后，使用串联质谱仪检测样本中游离肉碱（C0）及酰基肉碱（C2、C3、C16、C18等指标）水平。

1.4.2 筛查结果确认 本科室每年参加国家卫生健康委临床检验中心串联质谱室间质量评价活动，成绩均合格。室内质控：每一块板均做高值、低值两个浓度水平检测，质控值在有效范围内方进行实验数据分析，并送检测报告至遗传代谢病专科医生审核。遗传代谢病专科医生根据临床症状和专业知识进行检测报告的临床解读、判断。

1.4.3 PCD的筛查判断依据 根据试剂盒提供的新生儿C0 参考范围：10.0～48.2 μmol/L，C0＜10.0 μmol/L 视为可疑患儿，为避免母源性影响，需母婴同时召回复查串联质谱检测，C0仍低者外送血标本进行SLC22A5基因测序。PCD基因确诊依据：检测到SLC22A5基因突变。

1.5 统计学方法 采用SPPSS 13.0统计学软件进行数据处理。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

目前共计筛查22 950例黎族新生儿，初筛C0减低14例，初筛异常发生率为1/1 639（14/22 950），其中男7例（1/1 710），女7例（1/1 569）。不同性别黎族新生儿PCD初筛异常发生率比较，差异无统计学意义（χ2=0.026，P=0.872）。母婴同时召回14例，经复查后排除4例，10例新生儿及父母双方重采静脉血外送进行SLC22A5基因测序。结果显示，10例黎族新生儿均确诊为PCD，黎族新生儿PCD发生率为1/2 295（10/22 950），其中7例为杂合突变，3例为纯合突变；男5例（1/2 394），女5例（1/2 196）。不同性别黎族新生儿PCD发生率比较，差异无统计学意义（χ2=0.019，P=0.892）。共检出8种突变类型：5例c.51C＞G基因突变、5例c.760C＞T基因突变、2例c.338G＞A基因突变和1例c.428C＞T基因突变、1例c.1340A＞T基因突变、1例c.825G＞A基因突变、1例c.4442C＞T基因突变、1例c.1400C＞G基因突变（见表1、图1～2）。

3 讨论

PCD可于任意年龄发病，多数1个月～7岁发病，平均在2岁左右；PCD临床表现差异较大，主要有肌无力、心室肥厚、心功能不全、肝功能异常、低酮性低血糖、高血氨以及代谢性酸中毒等［10］，而且患儿疾病早期未被发现可能会引起生长发育迟缓［11］，该病被认为是一种潜在致死性疾病，及时医治或有效预防可以避免发生危及生命的情况［12］。因此，在新生儿群体中进行大规模PCD筛查，做到早发现、早诊断、早治疗是保障生命健康安全和提高人口素质的关键。

表1 10例PCD黎族新生儿的基因突变分析Table 1 Analysis of gene mutations in 10 Li neonates with PCD

图1 串联质谱检测PCD患者C0的离子质谱图Figure 1 Tandem mass spectrometry for detecting CO ion in patients with PCD

图2 基因测序PCD患儿c.760C＞T基因突变型纯合子和c.51C＞G基因突变型杂合子家族测序图谱Figure 2 Family sequencing map of homozygous c.760C＞T mutations and heterozygous c.51C＞G mutations

长链脂肪酸β氧化中作为亲水分子的肉碱发挥了重要作用，肉碱（3-hyrdoxy-4-正三甲氨基丁酸）是一种氨基酸化合物，是细胞代谢所必需的，为氧化磷酸化级联提供了基质，主要来源于肉类和奶制品等饮食，99.5%的全身肉碱在细胞内储存，0.5%作为C0在血浆中循环。肉碱会结合酰基残基进行脂肪酸代谢。该机制对于代谢或者去除异常有机酸具有重要意义，因此解释了异常有机酸的蓄积导致肉毒碱缺乏症的原因。串联质谱技术根据离子间质荷比不同区分不同的肉毒碱，由于肉毒碱与不同酰基残基之间结合会产生不同酰基肉碱，因此C0水平是诊断 PCD 的依据，也是判断临床治疗PCD疗效的重要指标［13］。串联质谱技术可以精细区分每种酰基肉碱水平，根据代谢理论判断标识性酰基肉碱代谢，从而达到诊断像PCD等脂肪酸代谢障碍的遗传代谢性疾病。目前国内对PCD的报道十分有限，鉴于该病具有种族差异性，海南省本就属贫困偏远地区，而黎族人群居住区域又属于困中之困，在目前全国大力发展精准扶贫的前提下，在海南省选择黎族人群开展新生儿PCD筛查和诊断，有利于黎族同胞的生命安全和为临床诊治PCD提供诊断依据，在新生儿期进行筛查又能防止因病致贫，进而起到医疗精准扶贫的作用。

本次调查结果显示，海南省黎族新生儿PCD的发生率较高，为1/2 295。关于PCD的发生率，国内青岛［14］、徐州［15］和广西桂中地区［5］也见部分报道，发生率为1∶55 636～1∶3 090，从本次调查可以看出海南省黎族新生儿PCD发生率（1/2 295）为最高。从性别角度统计PCD发生率和初筛异常情况，均未见有性别差异，这符合常染色体遗传规律。PCD的致病基因已被证实为SLC22A5，定位在染色体5q31.1，有10个外显子和9个内含子［16］，目前已发现至少存在183种突变，大多数突变集中于外显子1、4、8，占所有突变的77.6%，其中c.1400C＞G（p.S467C）、c.760C＞T（p.R254X）、c.51C＞G（p.F17L）突变是新生儿PCD最常见的基因突变位点［17］。本次在10例PCD黎族新生儿中检出8种基因突变：5例c.51C＞G基因突变、5例c.760C＞T基因突变、2例c.338G＞A基因突变和c.428C＞T、c.1340A＞T、c.825G＞A、c.4442C＞T、c.1400C＞G基因突变各1例。从本次所检出的突变位点来看，c.51C＞G基因突变和c.760C＞T基因突变占主要比例，这符合中国人群PCD常见突变位点［18］。本次收集的22 950例黎族新生儿PCD筛查结果证实了黎族新生儿中PCD患儿基因突变位点与汉族人群相似，用较大样本量数据否定了赵振东等［19］对黎族PCD患儿突变位点的推断，笔者认为随着样本量的不断扩大所得到的PCD发生率与基因突变位点才能更准确地代表黎族人群的数据，但仍有待不断累计大样本数据进一步证明。c.338G＞A基因突变是一种极为少见的PCD基因突变类型，目前报道很少［20］。该位点在保留了部分肉碱转运活性的前提下影响了肉碱转运蛋白（OCTN2）的糖基化和成熟作用，经多次随访，患者家属表示至今未出现任何临床症状。海南省地处祖国最南端，因海峡隔阻，交通不便，特别是受当地风俗和经济限制，黎族人群相对封闭，族内通婚多见，由此推测这可能增加了遗传性代谢病的发生概率。原卫生部2009年颁发实施的《新生儿筛查管理办法》规定新生儿疾病筛查只有苯丙酮尿症（PKU）和先天性甲状腺功能低下症（CH）两个病种，笔者认为从目前海南省黎族人群PCD发生率来看，在海南省其远高于以上两个病种的发生率的前提下［21-22］，应该在海南省黎族人群中开展大规模PCD筛查，以提高海南省黎族出生人口素质和质量。

诚然，本研究也存在部分局限性，比如新生儿黎族身份的确定，本研究是借助海南省新生儿筛查网络平台通过新生儿母亲的民族来确定新生儿的黎族身份，因查询不到新生儿父亲的民族情况，且黎族与其他民族通婚的情况是存在的，所以存在患儿种族身份也可能是其他民族的情况。此外，本研究只有22 950例样本，尚不能算作一个大样本的数据分析，统计结果可能存在偏差。

综上所述，海南省黎族新生儿PCD发生率较高，基因突变类型较为丰富，因此应在黎族人群进行串联质谱PCD筛查，做到早发现、早诊断、早治疗，对避免黎族出生人口缺陷具有重要意义。

作者贡献：温英梅负责文章的构思与设计，撰写论文，进行结果分析与解释：温英梅、王洁进行研究的实施与可行性分析，文章的质量控制及审校，对文章整体负责并监督管理；温英梅、赵振东负责数据收集、整理，统计学处理，论文修订。

本文无利益冲突。