胚胎植入前遗传学诊断应用于SLC26A4致聋突变家庭的临床研究

吴萧男关静马慜悦熊文萍#王洪阳赵翠兰兰彭红梅王秋菊*

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部，国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室；聋病防治北京市重点实验室（北京100853）

2中国人民解放军总医院妇产科（北京100853）

听觉功能障碍及其伴发的言语交流障碍是重大致残性疾病之一，其中50%～70%是由遗传因素引起的遗传性耳聋[1]，它是父母的遗传物质传递给后代所引起的听力损失。父母一方或双方可以是耳聋患者，也可以是听力正常的致病基因携带者[2]。其中75%～80%为常染色体隐性遗传，15%～25%为常染色体显性遗传，1%～2%为线粒体或X连锁遗传[3]。目前已有150多种基因被证实与人类听力损失有关（http://www.generaltyhearingloss.org），其中GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA是我国耳聋人群中最常见的3种致病基因，且通过大规模的新生儿听力与基因联合筛查发现，2019年报道我国新生儿中GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA的突变携带率分别为2.30%、2.27%和0.23%[4]。因此，如何有效阻止致聋基因在母亲受孕之前的传递，实现遗传性耳聋的源头一级预防，意义重要。2015年，本课题组与陈子江院士课题组合作通过胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD）完成了我国首例GJB2导致的极重度耳聋阻断其致病基因传递，迎来了一例听力正常珍贵儿的工作[5]，使有类似需求的家庭前来进行遗传咨询。这些携带耳聋基因的家庭希望通过PGD技术帮助孕育听力正常的胎儿[6]。由此，本研究分析了5组夫妻，双方明确携带SLC26A4基因，通过PGD技术帮助其生育听力正常儿的经验与效果。

1 研究对象

选取2016年1月至2018年12月于我院就诊寻求遗传咨询与生育指导的5组家庭。夫妻双方经传统经典的Sanger测序耳聋基因检测均携带导致大前庭水管综合征的SLC26A4基因致病突变（表1）。根据常染色体隐性遗传规律，5组家庭生育大前庭水管综合征患儿的几率为25%，生育携带者几率为50%，生育无致病基因携带的听力正常儿的几率为25%。5组家庭自愿申请希望通过PGD技术，指导生育听力正常儿。本研究方案已通过我院伦理委员会审批，纳入患者均已签署知情同意书。

家庭1：已育有一名先天性耳聋的患儿：SLC26A4 c.919-2A＞G/c.2168A＞G复合杂合突变及P2RX2 c.610C＞T杂合突变。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变及P2RX2 c.610C＞T杂合突变，母方：SLC26A4 c.2168A＞G杂合突变。

家庭2：已育有一名先天性耳聋的患儿：SLC26A4 c.919-2A＞G纯合突变。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变，母方：SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变。

家庭3：父方：SLC26A4 c.919-2A＞G/c.1334T＞G复合杂合突变，母方：SLC26A4c.147C＞G杂合突变。

家庭4：已育有一名先天性耳聋的患儿：SLC26A4 c.919-2A＞G纯合突变。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变，母方：SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变。

家庭5：已育有一名先天性耳聋的患儿：SLC26A4 c.1707+5G＞A/c.216C＞T复合杂合突变。父方：SLC26A4 c.1707+5G＞A杂合突变，母方：SLC26A4 c.216C＞T杂合突变。

2 研究方法

2.1 纳入遗传性耳聋PGD临床流程

所有拟作PDG的家庭签署知情同意书，由耳鼻咽喉科医师进行耳聋遗传咨询获得家系成员遗传信息，再经Sanger测序进行耳聋基因检测确定致聋基因。辅助生殖中心对夫妻双方进行辅助生殖前相关检查，包括夫妻双方染色体的核型分析、血常规、血生化、肝肾功能、血型、凝血四项，病毒五项；父方禁欲3-7天的精子形态和功能分析（至少2次）；母方常规妇科检查、宫颈细胞学检查、宫腔镜检查、经期第2-4天性激素水平检测、卵巢、甲状腺和乳腺超声检查等。

2.2 基因位点突变信息家系验证

采集家系成员外周血与口腔黏膜细胞，经单细胞全基因组扩增（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）与高通量测序技术，将家系gDNA与NCBI参考序列比较，进一步验证基因突变位点。

2.3 促排卵胚胎体外受精、培养

采用我院辅助生殖中心的常规方法进行控制性促排卵，体外精子与卵子受精发育成囊胚。

2.4 囊胚活检及遗传学诊断

抽取囊胚期滋养外胚层，运用MALBAC技术对囊胚细胞的遗传物质进行扩增，高通量测序检测目标区域是否携带耳聋基因—基因突变位点检测，用SNP分型技术分析基因突变位点连锁，验证突变位点的检测结果，并对滋养外胚层进行染色体非整倍体检测和10M以上片段重复或缺失情况检测，将活检后的囊胚采用玻璃化冷冻方法保存。

2.5 胚胎移植及临床妊娠确认

根据遗传学检测的结果，选取非致病基因型的囊胚进行子宫植入。胚胎移植后14天检测母方血人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），5-6周B超检测孕囊及胎心搏动可确定为临床妊娠。孕期严格产检至18-20周。

2.6 羊水穿刺诊断及出生后听力筛查

在孕18-20周时羊膜腔穿刺取羊水用于产前基因遗传诊断检测(具体方法同2.4)，进一步判断胎儿的基因型，明确为非致病性基因型，告知孕妇检测情况。正常分娩后，进行新生儿出生后的听力筛查。

3 结果

3.1 基因位点突变信息验证结果

5组家庭的夫妻双方经单细胞全基因组扩增与高通量测序技术，家系gDNA与NCBI参考序列比较，明确其基因突变位点与Sanger测序耳聋基因检测结果一致，可以进入PGD周期。

3.2 PGD结果

5组家庭PGD及囊胚数量、基因检测情况、胚胎选择情况、妊娠检测结果，最后分娩结果等请见表1。

表1 携带SLC26A4基因突变的5组家庭遗传咨询及PGD情况Table 1 Genetic counseling and PGD status in 5 families with SLC26A4 gene mutations

在上述过程中，有如下情况需要表明：

家庭1：第一次PGD进行两个基因的位点突变及连锁SNP分析时，SLC26A4基因SNP区域在单细胞扩增时效果较差，SNP数据量极少，胚胎携带突变位点情况根据目前仅有的位点无法进行等位基因脱扣的判断，存在一定风险。因此，不具备可选用囊胚移植机会。夫妻双方同意选择进行第2次PGD周期。

家庭3：第一次PGD培育出17个囊胚，其中有6个囊胚染色体形态数目正常。在这6个囊胚中有5个囊胚为复合杂合突变，1个囊胚为单杂合突变，与家庭3沟通后决定放弃移植。后该家庭选择自然受孕，并于受孕18周后进行羊水穿刺诊断，提示胎儿仅获得了父亲一人携带的耳聋突变基因，为单杂合突变（SLC26A4 c.919-2A＞G）。由于SLC26A4突变基因所致耳聋为常染色体隐性遗传，因此排除了胎儿由于SLC26A4基因突变所致聋的可能性。

家庭4：第二次PGD培育出13个囊胚，其中有8个囊胚染色体形态数目正常。在这8个囊胚中有1个囊胚为纯合突变，7个囊胚为单杂合突变。判断如果移植单杂合突变的囊胚，子代仅为耳聋基因携带者，不会因SLC26A4突变基因而罹患遗传性耳聋。与家庭4反复讨论，并告知其结果后，该家庭同意移植单杂合突变的2号胚胎。

家庭5：研究时未记录父方年龄，母方在第一次促排卵胚胎体外受精、培养过程中未能成功排卵，导致未能获取受精卵，后退出研究。父方年龄遂未知。

4 讨论

本研究针对临床聋病遗传咨询中5组夫妻双方均携带SLC26A4致聋基因的家庭，进行了PGD辅助生殖工作。在5组家庭中，有2组家庭（家庭1、家庭2）通过PGD成功受孕，并生育出听力健康儿；1组家庭（家庭3）选择自然受孕，并通过羊水穿刺明确子代仅携带耳聋基因，生育了听力健康儿；1组家庭（家庭4）仍在妊娠期，待日后随访进行羊水穿刺检查；1组家庭（家庭5）由于促排卵未能成功而退出研究。本研究中的5组家庭有4组家庭由于已经生育了一个大前庭水管综合证的患儿，迫切希望通过PGD在怀孕前即可了解植入胚胎耳聋基因携带状况，由此选择的PGD技术帮助他们生育未携带致病基因的胎儿，以避免遗传基因的代代传递。本临床研究中发现由于个体差异的存在，母亲身体状况不同，常规促排卵方案进行后排出的卵细胞数目不同，质量不同，存在由于获取的卵细胞数目较少而导致在一次PGD过程中不能找到合适的囊胚，从而无法植入胚胎的情况，也是本研究中的家庭1、2、4均进行第二次PGD及家庭3、5第一次PGD未能成功的原因。

因此，在遗传性耳聋中应用PGD技术是一个系统工作，需要多学科协作，更需要家庭的充分信任和积极配合，最后方可选择到未受致病基因影响的胚胎。

本研究中的家庭5，母方年龄39岁，超过了PGD建议年龄35岁之前为较佳年龄，常规促排卵方案未能成功排卵。随着母方年龄的增加，卵巢储备逐渐下降、对外源性促性腺激素的反应能力下降、获卵数目减少、卵母细胞质量(如非整倍体、染色体异常等)下降、优质胚胎率下降、胚胎着床率及妊娠率下降，流产率增加。因此母方年龄被认为是影响妊娠率的主要因素，间接影响PGD的成功[7,8]。

家庭1、家庭2结果的成功，得益于遗传学诊断方面的实验技术的发展。通过对胚胎进行非整倍体检测和致病基因位点检测双重检测相结合的遗传学诊断手段，能够避免PGD过程中选择非整倍体胚胎移植而导致流产，增加生育正常子代的成功率[9]；而为了避免因扩增失败、优势扩增、等位基因脱扣、样本污染等可能因素导致的误诊，我们在进行基因突变位点检测同时进行了SNP分型技术分析基因突变位点连锁，增加诊断结果的准确性[10,11]，这也是我们对家庭1进行第二次PGD的原因。在胚胎活检方面，由于卵母细胞减数分裂产生的极体进行活检仅能代表母方的遗传信息，而卵裂期囊胚活检发生嵌合的概率又高达60%，活检对嵌合现象的检测准确性低等，容易产生误诊。因此在本研究中，均选择吸取滋养外胚层进行活检，不仅能够改进上述的不足（虽然囊胚期胚胎的嵌合率较低，但仍存在由嵌合导致的误差）[12,13]，并且在胚胎活检诊断率与胚胎种植率上均有提高。滋养外胚层活检已成为越来越多PGD选择的活检方式[14,15]。

1990年，国际上首例由PGD技术诞生了第一名健康女婴以来，直至今日，PGD已经可以用于避免包括β-地中海贫血(beta-thalassemia)、囊性纤维化（cystic fibrosis）、亨廷顿舞蹈病(Huntington disease)在内的超过200种单基因遗传病的垂直传递[16]。而高通量测序技术的快速发展，通过将与疾病有关的序列制成特异性探针进行测序，将测序后的序列信息与人类基因组数据库序列进行对比，能够准确发现致病突变，取代了第一代测序技术通量低、检测周期长、成本高的缺点[17,18]，进一步促进了PGD技术在阻断遗传性耳聋致聋基因垂直传递中的应用。对于PGD用于阻断SLC26A4耳聋基因的案例，则最早由台湾的吴振吉教授等于2010年报道[19]。

本研究的5例PGD技术用于SLC26A4基因突变致聋家庭的案例，进一步丰富了PGD技术在遗传性耳聋应用的临床经验，为遗传性耳聋PGD临床流程的建立提供理论支持。综上，PGD能够在基因水平预防单基因遗传病的垂直传递，是遗传性耳聋家庭选择的一种重要的优生方式。