外周血miR-27a、miR-29b联合PSA检测在诊断前列腺癌中的应用

许贺春，成守金，王中良

（焦作煤业（集团）有限责任公司中央医院，1.检验科；2.消化内科，河南 焦作 454000）

前列腺癌（Prostate cancer，PC）是发生于男性前列腺的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，PC的诊断主要依靠直肠指诊、血清前列腺特异抗原（Prostate specific antigen，PSA）、盆腔 MR I检查等[2]。PSA是由前列腺上皮细胞分泌产生的一种具有组织特异性的丝氨酸蛋白酶，是PC的特异性标志物，但无肿瘤特异性，在良性前列腺增生和前列腺炎中其水平也会升高[3]。寻找新的特异性高的肿瘤标志物进行联合诊断对提高PC的早期检出率具有重要意义。miR-27a是前列腺集群调控反馈机制中的关键调控因子,可以调控前列腺癌的恶性生物学行为,促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[4]。miR-29b是miR-29家族的一员，可以靶向调节细胞增殖、分化、凋亡等相关基因的表达，参与多种肿瘤包括前列腺癌的发生发展[5]。因此，本研究检测了PC患者外周血中miR-27a、miR-29b和PSA的表达，分析了其联合检测在PC诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2016年12月至2018年12月在本院确诊的94例初诊PC患者的血清标本。纳入标准：均经病理组织学确诊，获得患者及其家属知情同意,通过本院医学伦理会批准。排除标准：合并严重免疫系统或血液系统疾病；合并严重心、脑、肝、肾等脏器功能不全者；合并其他部位的原发肿瘤。94例PC患者，年龄40～80岁，平均年龄（56.66±9.37）岁，根据临床病理分级：G1期 20 例，Gleason评分为 2～4分，G2期 28例，Gleason评分5～6分，G3期 46例，Gleason评分 7～10分；根据临床TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期38例，Ⅲ期11例，Ⅳ期15例。收集同期47例前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)患者的血清标本为BPH组，年龄 40～80 岁，平均年龄（55.84±8.72）岁。 收集同期47例健康体检者的血清标本为对照组，年龄40～80 岁，平均年龄（56.24±9.18）岁。三组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 材料与仪器 Trizol总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；7500 RT-PCR系统购自于美国Applied Biosystems；罗氏Elecsys E170电化学发光仪及配套试剂购自罗氏公司。

1.3 观测指标 所有纳入研究对象于清晨采集空腹静脉血3ml,3500rpm离心10min,分离上清。采用RT-PCR测定各组血清样本中miR-27a和miR-29b的表达水平，采用Trizol试剂提取样本的总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA OD值，确定RNA浓度，将其稀释到终浓度为1μg/μL，采用反转录试剂盒经反转录合成cDNA，参考已有文献和研究[6,7]，设计反应引物、条件和体系。miR-27a引物：正向5'-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3'，反向 5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；miR-29b 引物：正向5'-GGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'，反向5'-GCGGAACTTAGCCACTGTGA-3'，进行实时定量PCR反应，以GAPDH作为内参，采用循环阈值（Ct值）表示cDNA达到指数扩增所需的循环数,计算△Ct值=目的基因Ct值-参照基因Ct值，将△Ct值转化为表达量进行比较。采用罗氏Elecsys E170电化学发光仪及配套试剂检测总前列腺特异抗原（tPSA）、游离前列腺特异抗原（fPSA）以及fPSA与tPSA的比值（f/tPSA）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行分析，计量资料均以均数±标准差(x±s)表示，对计量资料首先进行正态性检验,如果各组均满足正态性且两组间方差齐,采用单因素方差分析比较组间差异性;若以上条件不满足则考虑非参数Mann-Whitney U检验，且差异均以P＜0.05表示具有统计学意义。采用ROC分析miR-27a、miR-29b联合PSA诊断PC的价值，曲线下面积（AUC）表示诊断价值。

2 结果

2.1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表达 与对照组相比，BPH和PC患者外周血中miR-27a mRNA的表达量显著上调 （P＜0.05），miR-29b mRNA的表达量显著下调（P＜0.05）；与 BPH组相比，PC患者外周血中miR-27a mRNA的表达量显著上调（P＜0.05），miR-29b mRNA 的表达量显著下调（P＜0.05），见表 1。

表1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的含量（x±s）

2.2 PSA在PC患者外周血中的表达 与对照组相比，BPH和PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平显著升高(P<0.05),f/tPSA的水平显著下降(P<0.05);与BPH组相比，PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平显著升高（P<0.05），f/tPSA的水平显著下降（P<0.05），见表 2。

表2 前列腺癌患者PSA血液中含量（x±s）

2.3 miR-27a、miR-29b、PSA 在 PC 中的诊断价值ROC 分析显示，miR-27a、miR-29b、tPSA、f/tPSA、tPSA联合f/tPSA以及三者联合诊断PC的AUC依次为 (0.816±0.032)、(0.792±0.032)、(0.837±0.027)、(0.833±0.027)、(0.882±0.022)、(0.958±0.013)，且三者联合诊断的AUC显著高于其单独诊断的AUC（P<0.05），见图 1、表 3。

3 讨论

PC是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制非常复杂，与遗传因素相关,早期常无症状，临床易出现漏诊或误诊，早期诊断率较低[8]。目前，血清tPSA、fPSA是PC患者最主要的诊断筛选方法[9]。PSA是前列腺上皮细胞分泌产生的一种激肽酶家族蛋白，在血清中主要以fPSA、与α1-抗糜蛋白酶结合形成的复合物（PSA-ACT）以及与α2-巨球蛋白酶结合形成的复合物三种形式存在,是诊断PC的首选标志物[10]。在生理情况下，PSA在血清中水平极低，一旦前列腺组织受到刺激、损伤或发生病变,会释放大量的PSA进入血液中,主要以PSAACT的形式存在于血清中[11,12]。本研究中，PC患者血清tPSA和fPSA水平均显著升高，f/tPSA显著下降，且对PC患者均具有一定的诊断价值。王祺等[13]的研究显示，tPSA、f/tPSA对PC具有较高的诊断价值，但其缺乏肿瘤组织特异性，不足以发现早期患者，与本研究结果基本一致，提示tPSA、f/tPSA可用于临床PC的诊断,但其存在一定的局限性，寻找新的PC血清肿瘤标志物，进行联合检测对提高PC患者的早期诊断率具有重要意义。

图1 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的诊断价值

表3 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的诊断ROC特征

miRNAs是一类非编码RNA，可以同时调控多种基因以及多条信号通路,在多种癌症的发生发展中发挥着重要的作用。本研究检测了miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表达,发现miR-27a的表达量显著升高，miR-29b的表达量显著下降，且均对PC具有一定的诊断价值。miR-27a是近年来发现的癌症相关的miRNA,可通过负调控多种靶向基因发挥其生物学功能，参与乳腺癌、胰腺癌、PC等多种癌症的发生发展[14,15]。Wan等[16]的研究表明，miR-27a可以作用于雄性激素和PC之间，参与PC的集群调控反馈机制，促进PC细胞的快速增殖，有望作为PC早期诊断和治疗的分子标识物,与本研究结果基本一致，提示miR-27a在PC患者外周血中的异常高表达可作为其诊断标识物。miR-29b为一种抑癌基因，在多种肿瘤组织中均表达量下降，可以参与机体的多条信号通路，调控肿瘤细胞的生物学行为[17]。Zhu等[18]的研究显示，miR-29b可以抑制多种癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，在PC的诊断中具有重要意义,与本研究结果基本一致，提示miR-29b在PC患者外周血中表达量降低可能与PC细胞的恶性生物学行为有关，其表达量下降对PC具有一定的诊断价值，有望作为其治疗的新靶点。本研究联合miR-27a、miR-29b以及PSA诊断,发现其联合诊断的AUC显著高于其单独诊断的AUC，提示联合诊断可以显著提高PC患者的诊断率，临床在条件允许的情况下，可以采用联合诊断的方法，一期提高其诊断率。

综上所述，PC患者血清tPSA、fPSA和miR-27a水平均显著升高，f/tPSA和miR-29b显著下降，且其均对PC具有一定的诊断价值，miR-27a、miR-29b联合PSA诊断可以显著提高其诊断价值，有望作为其诊断和治疗的标识物。但miR-27a、miR-29b作用于PC的具体机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。本研究不足之处在于样本数量较少，可能会对结果造成一定的统计学误差，但本研究仍为PC的诊断和治疗提供了新的理论依据。