应用16S rRNA基因序列分析鉴定从痰培养中分离的假肺炎链球菌

赖希希，蔡鹏威，王军军，屈平华

（1.福建省立金山医院检验科，福建 福州 350028；2.广东省中医院检验医学部，广东 广州 510006）

假肺炎链球菌 （S.pseudopneumoniae）是Arbique[1]等2004年命名的菌种。该菌是一种草绿色链球菌，属于缓症-口腔链球菌复合群，其在遗传学上与肺炎链球菌十分接近，并因故而命名。在生物学特征上，假肺炎链球菌不含肺炎链球菌荚膜，不溶于胆汁,在5%CO2气体环境中对奥普托辛（OP）纸片耐药或不确定的敏感性，但在大气中培养时敏感，可与肺炎链球菌进行鉴别[1]。我们最近通过痰涂片和质谱鉴定技术,确定了一例假肺炎链球菌的临床感染，现报告如下。

1 病例摘要

患者，男，76岁，既往有心脏病和慢性阻塞性肺病病史。入院一周前不慎受凉，期间反复低热，因突发胸闷、气促、痰多而入院。入院检查，血常规提示中性粒细胞升高，CRP（24.9mg/l）、PCT（0.1ng/ml）等炎症指标升高，胸部CT提示肺部炎症、肺结构改变，血气分析：氧合低（60mmHg）、二氧化碳不高（40mmHg），听诊双肺啰音明显，诊断Ⅰ型呼吸衰竭、慢性阻塞性肺病急性加重、肺部感染明确，痰涂片革兰阳性菌可见吞噬，盐酸莫西沙星静滴（0.4g）经验性抗感染，吸氧，雾化治疗。治疗第二天，患者咳嗽、咳痰减轻，改口服盐酸莫西沙星片（0.4g），痰培养结果为假肺炎链球菌，青霉素敏感，左氧氟沙星敏感，继续目前抗感染方案。第四天，患者少许咳痰，无发热，血象正常，停用抗生素。

2 细菌培养鉴定

深部痰标本接种哥伦比亚血琼脂平板、巧克力平板和麦康凯平板,放入37℃5%CO2孵育箱中培养24小时，原始痰涂片镜检为合格标本，其中多形WBC>25/LP，SEC<10/LP，大量革兰阳性球菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，形似肺炎链球菌，且白细胞空泡内有菌体(见图1)。痰培养结果为草绿色链球菌生长 （3+)，其菌落较干燥，与典型的肺炎链球菌的菌落形态存在差异（见图2）。以配置0.5麦氏菌液涂布于绵羊血琼脂平板，并将奥普托辛纸片置于平板的中心，分别放置在37℃5%CO2和大气环境中孵育过夜。试验结果显示，CO2环境的抑菌圈直径大小为15mm,大气环境的抑菌圈直径大小为25mm（见图3）。对该菌进行了Vitek MS质谱鉴定,质谱鉴定结果显示为假肺炎链球菌,可信度99.9%。为保证鉴定结果的准确性，我们还进行了16S rRNA基因测序鉴定。采用16S rRNA基因通用引物，27F（5'-AGA GTTT GATYMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTT GTTACGACT T-3'）进行PCR扩增，扩增产物进行测序，测序序列进行比对[2]，结果显示该菌与肺炎链球菌的相似度99.63%,与假肺炎链球菌的相似度99.75%（见图4）,与假肺炎链球菌的相似度更高，结合表型鉴定结果，可进一步确定分离株为假肺炎链球菌。药敏试验：VITEK2 GP68重复2次,且延长孵育时间至48h，但均未生长。手工药敏,青霉素：35mm，万古霉素：26mm，克林霉素：30mm，红霉素：31mm，四素素：30mm，复方新诺明：21mm，苯唑西林：18mm，左旋氧氟沙星：25mm。

图1 痰涂片镜检（1000倍）

图2 痰培养的血平板生长状况

图3 OP试验结果（左图为CO2环境，右图为大气环境）

图4 分离株的16S rRNA基因测序鉴定结果

3 讨论

假肺炎链球菌最常见于呼吸道标本,与慢性阻塞性肺疾病和吸入性肺炎相关[3,4]，也可从血液[5]、腹水[5]、眼结膜[5,6]以及其他无菌部位分离出。假肺炎链球菌不含肺炎链球菌荚膜,不溶于胆汁，在5%CO2气体环境中对奥普托辛（OP）纸片耐药或不确定的敏感性，但在大气中培养时敏感，可与肺炎链球菌进行鉴别,用基因探针和PCR扩增特征性基因溶肺链菌素基因(ply)和锰依赖性超氧化物歧化酶基因(sodA)均不能将其与肺炎链球菌鉴别开。经DN A-DNA同源性比较研究确定它是一个新种,命名为假肺炎链球菌[1]。假肺炎链球菌的抗菌素耐药性已经被证实，并且比肺炎链球菌更耐药[3,7,8]。回顾以往的报道，大部分的假肺炎链球菌对红霉素、四环素和青霉素耐药[3,5,7,8]。由于该菌的菌落为草绿色链球菌样，易被临床微生物检验工作者所忽视，故国内的临床报道较为少见,临床微生物工作者应提高对原始涂片的重视[9,10,11]，避免遗漏假肺炎链球菌的检出，造成临床诊断和病情预测偏差，日常工作中若怀疑有假肺炎链球菌时,可同时做5%CO2及大气环境中OP试验，作为简便快速的初筛试验。

近年来,随着生物技术和分子生物学的不断进步，细菌的分类鉴定已不再囿于传统的物理形态、生理生化鉴定,而是进入到了分子基因水平[2,7,12,13]。基于细菌16S rRNA基因的PCR扩增与测序同国际公认的公共核酸序列数据库比对,结合计算机的大数据分析，被证明是鉴定病原菌快速、有效、准确的方法[2,7,12]。与表型特征分类方法相比,16S rRNA基因序列测定在分析鉴定细菌进化过程、亲缘性方面具有突出优势,令人鼓舞的是目前绝大部分的原核生物细菌已被测定,日常一部分用表型方法鉴定有困难、不明确、不能培养、培养时间久或者难以培养的细菌，运用16S rRNA基因序列分析通常能进行准确地鉴定。16S rRNA基因序列分析不仅可用于分析临床中出现的少见菌、疑难菌、新发传染性细菌，甚至还可以初步鉴定细菌新种，这对于提高临床微生物检验的能力和水平大有裨益[14]。本文通过这种基因测序分析法,结合表型及生化特征分析,成功地对这株假肺炎链球菌进行了鉴别。