1844例新型冠状病毒核酸检测及生物安全防护实践

周丹，何进才，黄涛，李惠贞，张德明，谷大伟，罗胜华

（深圳市中医院检验科,广东 深圳 518033）

新冠肺炎（corona virus disease 19,COVID-19）是由新型冠状病毒[1，2]（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2,简称新冠病毒）感染所致的肺部炎症，人群普遍易感，自2019年12月在武汉被发现以来，迅速蔓延至全中国乃至全球，截至2月28日24时，31个省（自治区、直辖市）以及新疆生产建设兵团累计确诊病例79251例[3]。新冠病毒是冠状病毒β属的新成员，属于单链RNA病毒，可引起人类呼吸道感染，其基因特征与重症急性呼吸综合征（SARSr-CoV）和中东呼吸综合征（MERSr-CoV）有明显区别[4]。新冠肺炎诊疗方案（试行第六版）中提到，病原学证据是新冠肺炎诊断的金标准。临床病例或疑似病例具备实时荧光RT-PCR新冠病毒核酸阳性或病毒基因测序与已知的新冠病毒高度同源,即为确诊病例[4]。然而病毒测序对实验室技术、人员、设备等要求较高，因此荧光RT-PCR是目前新冠肺炎确诊中使用最广泛的方法。现将实时荧光RT-PCR在本院病例检测中的应用情况及实践经验报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源 选取2020年1月30日－2020年2月28日就诊于本院发热门诊的患者 （包括发热患者、湖北旅居者以及密切接触者、外地返深人员）,共 1844 例。

1.1.2 试剂与仪器 试剂采用湖南圣湘生物科技有限公司生产的核酸提取试剂盒及新型冠状病毒核酸检测试剂盒。仪器使用安捷伦MX3000P荧光定量PCR仪和罗氏cobas z480荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采用预约模式集中采样,每天分两个时段，上午和下午各一批，由发热门诊经过生物安全培训合格并穿戴生物安全三级防护的医生进行采样，每个病例采集口咽拭子。对多次检测阴性或高度疑似的患者,由临床医生根据需要采集鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或肛拭子等。

1.2.2 样本包装、运送及接收 样本采集后放入带螺旋盖有垫圈、耐冷冻的病毒保存管，拧紧，管外贴条形码。样本管喷洒75%酒精消毒后放入密封袋，每袋限一份样本。收集样本后竖置放于样本运送盒,盖紧盖子，置于感染性样本运输箱进行运输，运输箱上标明“新冠检测”。样本由经过生物安全培训合格的专人送至实验室。接收人员用75%酒精喷洒样本运输箱外表面后打开,再用75%酒精喷洒样本运送盒,最后取出样本运送盒放入生物安全柜中打开，核对样本数量，检查样本有无泄漏。

1.2.3 样本核酸提取及扩增 采用磁珠法提取核酸RNA，试剂盒包含裂解液、磁珠结合液、磁珠洗涤液、磁珠、洗脱液等。核酸扩增以新冠病毒开放读码框 1ab（open reading frame,ORF1ab）及编码核衣壳蛋白（nucleoprotein,N）基因的特异性的保守序列为靶区域，设计双靶标基因。配以PCR反应液，于荧光定量PCR仪上通过荧光信号的变化实现RNA的检测。

1.2.4 结果解读分析 实验采用的PCR检测体系包含内源性的内标引物（IC），通过检测内标是否正常来监测样本采集、核酸提取及扩增过程，避免假阴性结果。每批次实验中设置3个阴性质控和1个临界阳性质控，随机插入样本中同步检测，监控实验结果是否有效。结果分析时应先查看阴、阳性质控品结果,阴性质控品FAM、ROX通道均无Ct值或Ct＞40；阳性质控品FAM、ROX通道及内标（HEX）通道Ct≤35，若质控品的结果均满足以上要求,此批次实验有效,否则实验无效,需重新检测。

每个检测样本的结果需参照试剂盒说明书要求，结果分析如下：⑴对于FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，可报告为样本SARS-CoV-2核酸阳性。⑵对于FAM且ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线（No Ct），或Ct＞40，HEX通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，可判断为样本SARS-CoV-2核酸阴性。⑶对于FAM、ROX、HEX通道均未检测到典型的S型扩增曲线（No Ct）或 Ct＞40，表示样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本检测结果无效，需查找并排除原因，并对此样本重新采样进行重复试验。

1.2.5 实验室生物安全防护 实验室生物安全管理严格按照国家卫生健康委员会公告 （2020年第1号）规定要求[5]，新型冠状病毒肺炎纳入法定传染病乙类管理，采取甲类传染病的防控措施。在开展新冠核酸检测前，根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》[6]、《2019新型冠状病毒肺炎临床实验室检测的生物安全防护指南》[7]等文件,我们对实验室进行了充分的评估,精心设计检测流程，做到每一个环节都有相应的防护措施。

1.2.5.1 单位资质 医院为三级医院,实验室为经二级生物安全实验室备案和省级临床基因扩增检验实验室备案,有生物安全三级实验室防护装备储备。

1.2.5.2 个人资质 检测人员取得市级以上病原微生物实验室生物安全培训证书和临床基因扩增检验技术人员上岗证书，并经过新冠病毒核酸检测培训合格并授权。

1.2.5.3 人员防护 样本采集和核酸检测人员采用三级生物安全防护,样本运送及接收人员采用二级生物安全防护。

1.2.5.4 核酸检测 核酸检测每批次由两名实验人员来完成，一名进行核酸提取，一名进行反应体系的配制及核酸扩增上机。核酸提取人员在清洁区穿戴三级生物安全防护用品，并由另一人员检查，确保防护有效后进入实验区进行核酸提取。核酸提取全程在生物安全柜中操作，动作应轻柔缓慢，避免产生气溶胶;标本离心后将离心机转子放置到生物安全柜中再打开;混匀器放置于生物安全柜中进行震荡混匀。生物安全柜内放置小型垃圾桶，套黄色垃圾袋,并倒入适量2000mg/L有效氯消毒液，所有加样后的枪头等废弃物均丢弃在含消毒液的垃圾桶中。

1.2.5.5 检测后样本保存及处理 核酸检测阳性样本送至市疾控复核；阴性样本视为高危医疗废物，放入高压灭菌袋，经121℃30min高压灭菌后再按一般医疗废物移出实验室。

1.2.5.6 医疗废物处理 所有垃圾均视为有疑似新冠高危医疗废物,固体废物装入黄色垃圾袋并用鹅颈结封口,套入高压灭菌袋,在标本制备区进行121℃30min高压灭菌后再沿一般医疗废物通道移出实验室。核酸提取过程中产生的废液,采用2000mg/L的有效氯消毒液浸泡过夜后,排入下水道。

1.2.5.7 实验室消毒 ⑴实验前,打开实验室空气消毒机消毒1h。⑵每天新鲜配制消毒液，消毒液有效时间＜24h。⑶每次实验前后，用75%酒精擦拭生物安全柜，切忌不能喷洒。⑷实验结束后，台面用1000mg/L的有效氯消毒液或75%酒精擦拭消毒；地面采用1000mg/L的有效氯消毒液拖地消毒。⑸台面地面消毒后，打开生物安全柜紫外消毒灯，消毒时间＞60min；打开实验室固定紫外灯,消毒时间＞60min。⑹消毒完毕后，再打开窗户进行通风。⑺若检测到阳性样本,采用7.5%过氧化氢喷雾对实验室进行终末消毒。⑻工作结束时将所有消毒措施记录于实验室消毒登记表中。

1.3 统计分析 本研究为观察性研究，描述性报道事件计数，无统计检验。

2 结果

2.1 样本检测结果 受检的1844例样本中,其中咽拭子1836例,肺泡灌洗液4例，鼻拭子1例，肛拭子3例。新冠核酸阳性2例，均为咽拭子样本，其中男性1例，女性1例，且都有新冠患者密切接触史。Ct值分别为35.72和38.60。见图1、图2。

图1 两例阳性样本内标扩增曲线

图2 两例阳性样本ROX及HEX通道扩增曲线

2.2 可疑结果处理 1844例样本共进行了59批次实验,在第50批次实验中有1例患者首次取样结果FAM荧光通道有S型扩增曲线，但 Ct＞40，扩增曲线见图3，结果可疑。遂与临床医生沟通后，让患者留观隔离，下午重新留取咽拭子及痰液样本检测，扩增曲线见图4，结果为阴性，最终患者解除隔离。

2.3 质控失控处理 在第52批次实验中阳性质控品ROX和FAM通道未出现S型扩增曲线，HEX通道有S型扩增曲线，阳性质控品失控，显示本批次实验无效，见图5。将本批次样本复测，复测后阴性、阳性质控品在控，样本结果为阴性，见图6。

图3 FAM通道有扩增的疑似样本扩增曲线（典型S型扩增曲线为阳性质控品）

图4 重留咽拭子及痰液复测扩增曲线（S型曲线为阳性质控品）

图5 阳性质控品ROX和FAM通道无S型扩增曲线

图6 复测后阳性质控品及样本结果

3 讨论

实时荧光定量PCR被广泛用于各种病原体的核酸检测，具有敏感性高、特异性好等特点。一个月内,我院采用实时荧光定量RT-PCR方法完成了1844例样本的筛查，检测出2例阳性样本，且经市疾控复核亦为阳性。2名核酸阳性患者在第一时间转入了我市定点治疗医院，避免了扩大感染。核酸检测的开展，为大范围的核酸筛查提供了便利，大大缓解了市疾控的检测压力,有效的缩短了就诊患者检测等候时间,实现了在接诊6小时内出具核酸检测报告。

通过共59批次试验的检测实践，在核酸检测的质量控制及生物安全防护方面,我们也积累了以下经验。在第50批次实验中有1例患者在首次取样结果中FAM荧光通道有S型扩增曲线,但 Ct＞40，我们立即与临床沟通,将患者暂时作为疑似病例处理，进行留观隔离，重新采集咽拭子及痰标本进行复测，复测结果阴性，患者解除隔离。鉴于防疫工作的重要性,我们不放过任何一个可疑的结果,在不确定的情况下，建议对患者采取相应的隔离、监管措施。同时我们也对检测结果负责，对有疑问的样本使用不同厂家试剂或不同类型样本进行复核。在第52批次实验时,阳性质控品ROX和FA M通道未出现S型扩增曲线，HEX通道有S型扩增曲线,显示此次实验无效。我们立即分析原因，最后发现是因为使用了前1天未使用完的反应液,反应液失效导致阳性质控品ROX和FAM通道未出现S型扩增曲线。遂将该批次样本复测，复测后，阴、阳性质控品均在控，样本检测结果核酸阴性。此次失败提示我们反应体系必须现配现用。

近期有媒体报道连续多次核酸检测才检出阳性的病例，对核酸检测的结果提出质疑。通过阅读文献,我们知道核酸检测结果与患者病程发展及用药情况、采样情况、样本运输和保存、检验技术方法等因素相关[8]。采样部位不同，样本病毒含量不同；不同病毒采样管内保存液体积、成分不同，直接影响核酸的提取效率；实验操作人员的技能，检测方法、仪器的灵敏度等也会影响新冠核酸的检出率。当出现可疑结果时，我们首先从以上方面寻找原因，再及时与临床的医生沟通，结合患者临床情况,选择不同的样本或者采用不同试剂和方法进行复核。

新冠核酸检测须在三级生物安全实验室或者二级生物安全实验室加三级生物安全个人防护下开展。每批次实验由两人完成，在穿戴防护用品时可帮助检查，确保安全有效。在结束核酸检测工作后，对进行新冠检测操作的安全柜、台面及实验室环境进行有效的消毒;同时严格按照要求进行防护装备的脱卸，注意尽量避免碰到污染面，且脱卸的每一步后均应有手消毒，防护服、医用帽及医用口罩等一次性物品不能重复时候用,全部脱卸完成后,进行手卫生及消毒。进行严格分区的实验室，可在清洁区或缓冲区进行三级生物防护品的穿戴，在缓冲区进行帽子和口罩的脱卸，再进行手卫生及消毒。核酸检测过程中产生的垃圾，均应进行高压灭菌后才能沿一般医疗废物通道移出实验室。

综上,严格的质量控制和有效的生物安全防护保证了新冠核酸检测安全高效的开展,及时准确的检测结果为新冠肺炎的早发现、早诊断、早治疗提供精准依据。